宾赛克嗪拮抗M和N胆碱受体的特征及其抗胆碱酯酶抑制剂的毒性效应

崔文玉，张雁芳，潘志远，赵想弟，龙超良，汪 海，

(1.军事医学科学院卫生学环境医学研究所，北京 100850;2.北京赛德维康医药研究院，北京 100039)

有机磷酸酯类胆碱酯酶抑制剂(acetylcholinesterase inhibitors，ChEI)中毒是军事医学和公共卫生安全普遍关切的重要问题。以M受体拮抗剂阿托品和胆碱酯酶复活剂为核心的综合治疗，死亡率仍然在20%以上［1－3］。因此，开发新的防治药物，进一步降低死亡率，具有重要的价值。研究表明［4－7］，同时抗M和抗N治疗能大幅提高抗毒疗效。开发具有抗M和抗N作用的双靶向药物是进一步提高成功率的重要策略［8］。宾赛克嗪(benthiactzine)是一种具有抗M和抗N作用的双靶向药物，受体放射性配体结合实验证明宾赛克嗪对5种不同亚型M受体(M1～M5)的亲和力均弱于阿托品，但具有亚型选择性;对中枢和外周各组织的亲和力均弱于阿托品;具有不同的组织选择性作用［7］。那么，宾赛克嗪对中枢和外周M受体功能的拮抗作用是否也都弱于阿托品?其对中枢和外周神经元N受体功能的拮抗作用强度如何?宾赛克嗪高效抗毒的药理学基础何在?本研究系统地评价了宾赛克嗪拮抗胆碱受体功能的药理学特点，并与经典抗毒剂阿托品作比较;在敌敌畏染毒小鼠模型上研究了宾赛克嗪的抗毒作用，为其应用于临床提供实验依据。

1 材料与方法

1.1药品试剂宾赛克嗪(benthiactzine)由北京赛德维康医药研究院提供，批号050818，纯度≥99%。阿托品(atropine)、槟榔碱(arecoline)、毛果芸香碱(pilocarpine)、化震颤素(oxotremorine，Oxo)、溴代乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)均购自美国Sigma公司;烟碱(nicotine)和烟碱酒石酸盐〔(－)-Nicotine hydrogen tartrate salt〕购自Merck公司;80%敌敌畏乳剂(DDVP)购自河北新丰农药化工股份有限公司;其他试剂为国产分析纯。药物均用生理盐水稀释至所需浓度，DDVP用1%的吐温-80稀释至所需浓度。

1.2实验动物昆明小鼠，♀♂各半，体质量(21±3)g，按照随机数字表法进行实验分组，每组10只;豚鼠，♀♂各半，体质量(300±100)g。以上动物均由军事医学科学院动物中心提供，合格证号:SCXK(军)2007-004。

1.3方法

1.3.1槟榔碱诱发小鼠中枢性震颤和外周流涎

皮下注射槟榔碱8.0 mg·kg－1，2 min后，小鼠呈兴奋症状，首先尾巴充血，竖起，有轻微的抖动，弓背，步态不稳，逐渐发展为全身性震颤。以全身性震颤为指标，观察药物抗中枢M受体作用;以唾液分泌为指标，观察药物抗外周M受体作用。腹腔注射药物预防15min后，再给予槟榔碱，观察10 min内小鼠震颤及分泌发生率［4］。

1.3.2毛果芸香碱诱发小鼠外周流涎小鼠腹腔注射毛果芸香碱40 mg·kg－1，10 min内可诱发全部动物发生流涎。在此模型上，腹腔注射预防给药15min，再给予毛果芸香碱，观察小鼠流涎的发生率［4］。

1.3.3烟碱诱发小鼠惊厥小鼠尾静脉注射烟碱1.0 mg·kg－1，可立即诱导动物出现阵挛性和强直性惊厥。在此惊厥模型上，腹腔注射预防给予不同剂量的宾赛克嗪，15 min后再给予烟碱，观察小鼠惊厥发生率，分析药物抗中枢N受体的作用强度［6］。

1.3.4烟碱和毛果芸香碱合用诱发小鼠混合性震颤小鼠单独注射给予毛果芸香碱并不引起震颤，但可明显增强和延长烟碱所引起的混合性震颤［9］。小鼠腹腔注射毛果芸香碱50 mg·kg－1，20 min后腹腔注射烟碱2.5 mg·kg－1，10 min后小鼠全部出现头、体、尾混合性震颤。在此震颤模型上分别给予不同剂量宾赛克嗪和阿托品15 min，观察药物对抗此型震颤的作用。

1.3.5离体豚鼠回肠收缩实验将豚鼠击头致昏后，迅速打开腹腔取出距盲肠10 cm的回肠1.5 cm，在其两端各扎一线，一端与张力换能器相连，一端悬挂于含有Krebs液的恒温(37℃)浴槽内，肠管台式营养液(mmol·L－1):NaCl 137，KCl 2.7，CaCl21.8，MgCl21.1，NaH2PO40.4，NaHCO312，葡萄糖 5.6。通入95%O2+5%CO2气体，调标本负荷至3 g，稳定20 min后，给予激动剂诱发离体回肠收缩，观察标本对其收缩幅度，并以足量台氏液洗脱，达到稳定收缩幅度后，稳定10 min。给予不同浓度的药物预孵育10 min，再加入等剂量激动剂诱发回肠收缩，记录其收缩幅度，并与给药前的收缩幅度相比较，求出药物抑制激动剂诱发收缩的百分率。其中ACh和Oxo 的浓度均为 0.2 μmol·L－1，烟碱盐的浓度为10.0 μmol·L－1。抑制率/%=(给药前收缩幅度 －药物对抗收缩幅度)/给药前收缩幅度×100(%)，再作量－效关系曲线，用Bliss法求IC50、L95、b±sb和r值［10］。

1.3.6抗DDVP中毒实验［11］DDVP 的 LD50:小鼠皮下注射不同剂量的敌敌畏，观察动物24 h死亡率，用Bliss法计算敌敌畏的LD50。

药物抗毒PR值测定:小鼠分别腹腔注射给予宾赛克嗪或阿托品(均为10 mg·kg－1)，10 min后皮下注射DDVP染毒，观察小鼠24 h死亡率，计算药物预防后DDVP的LD50。PR值=药物预防后的LD50/未给药时的LD50。

药物抗致死作用:分别腹腔注射宾赛克嗪和阿托品，15 min后皮下注射致死剂量DDVP 1.2LD，观察动物24 h的存活率。

1.4统计学分析整体实验中均采用Bliss法计算ED50±L95、b ±sb、r值，并用 SPSS 软件进行 Probit法分析比较;离体实验采用Bliss法计算参数并用Logistic法比较曲线间的差别。

2 结果

2.1宾赛克嗪拮抗M受体功能的特点

2.1.1中枢抗M作用槟榔碱8.0 mg·kg－1可激动中枢M受体，诱发全部小鼠产生震颤。宾赛克嗪抗槟榔碱诱发小鼠中枢性震颤的ED50±L95为(0.31±0.06)mg·kg－1，比阿托品(1.33 ±0.17)mg·kg－1强3.3 倍(Fig 1A，Tab 1)。

2.1.2外周抗M作用

2.1.2.1抗槟榔碱诱发小鼠流涎 槟榔碱8 mg·kg－1可激动外周M受体，诱发全部小鼠唾液分泌亢进。宾赛克嗪抗槟榔碱诱发小鼠流涎的ED50±L95为(0.38 ±0.09)mg·kg－1，比阿托品(0.23 ±0.25)mg·kg－1弱 1.2 倍(Fig 1B，Tab 1)。

2.1.2.2抗毛果芸香碱诱发小鼠流涎 毛果芸香碱40 mg·kg－1可激动外周M受体，诱发全部小鼠流涎。宾赛克嗪抗毛果芸香碱诱发小鼠流涎的ED50±L95为(5.57 ±1.30)mg·kg－1;比阿托品(0.46 ±0.18)mg·kg－1弱11 倍(Fig 1C，Tab 1)。2.1.2.3抗ACh诱发回肠收缩 宾赛克嗪和阿托品拮抗0.2 μmol·L－1ACh诱发离体回肠收缩的IC50± L95分别为(16.19 ±4.46)nmol·L－1和(13.60±1.05)nmol·L－1。宾赛克嗪的作用与阿托品相比稍弱，用Logistic法对两曲线做F检验，F值=1.62，P=0.28＞0.05，两药的 IC50差异没有显著性(Fig 2A，Tab 2)。

2.1.2.4抗Oxo诱发回肠收缩 宾赛克嗪和阿托品拮抗0.2 μmol·L－1Oxo诱发离体回肠收缩的IC50± L95分别为(12.48 ±3.07)nmol·L－1和(13.71 ±1.24)nmol·L－1。用 Logistic法对两曲线做F检验，F值=1.43，P=0.33＞0.05，两药的IC50差异没有显著性(Fig 2B，Tab 2)。

Tab 1 The ED50values of drugs on different cholinergic receptor agonists-induced manifestations

Fig 1 Dose-response curves of benthiactzine on different cholinergic receptor agonists-induced manifestations in mice

Fig 2 Antagonistic effects of drugs on different cholinergic receptor agonists-evoked contractions of isolated ileum preparations derived from gunea pigs(±s，n=5～7)

2.2宾赛克嗪拮抗N受体功能的特点

2.2.1中枢抗N作用小鼠静注游离烟碱1.0 mg·kg－1可激动中枢N受体，迅速诱发全部动物产生阵挛和强直性惊厥。宾赛克嗪抗烟碱诱发惊厥的ED50± L95为(2.87 ±0.76)mg·kg－1(Fig 1D，Tab 1)。而M受体拮抗剂阿托品20 mg·kg－1以上仍不能对抗烟碱诱发的惊厥，剂量高达60 mg·kg－1时抗惊厥率仍然 ＜20%［9］。

2.2.2抗外周神经元N受体作用宾赛克嗪和阿托品抗烟碱诱发离体回肠收缩的IC50±L95分别为(1.10 ±0.18)μmol·L－1和(13.84 ±1.68)μmol·L－1。用 Logistic法对两曲线做F检验，F值 =13.26，P=0.0140.05，两药的 IC50差异有显著性。宾赛克嗪比阿托品的作用强约13倍，具有明确的外周抗N作用。阿托品在大于75 μmol·L－1时可以完全抑制烟碱诱发回肠收缩，可能与其高浓度时使肠平滑肌麻痹有关(Fig 2C，Tab 2)。

Tab 2 The IC50values of drugs on different cholinergic receptor agonists-evoked contractions of isolated ileum

2.3宾赛克嗪对烟碱和毛果芸香碱合用诱发混合性震颤的拮抗作用给予毛果芸香碱50 mg·kg－1和烟碱2.5 mg·kg－1后，小鼠全部出现头、体、尾混合性震颤。宾赛克嗪抗毛果芸香碱和烟碱诱发混合性震颤的 ED50± L95值为(2.64 ±0.35)mg·kg－1，比阿托品(4.95±0.65)mg·kg－1强约 1倍(Fig 1E，Tab 1)。

2.4宾赛克嗪拮抗胆碱能受体的药理学特征分析

从以上实验结果可知:①宾赛克嗪在整体水平上对中枢M受体功能的拮抗作用强于阿托品;对外周M受体功能的拮抗作用弱于阿托品;②宾赛克嗪具有较强的拮抗中枢和外周神经元N受体功能的作用。

2.5宾赛克嗪和阿托品抗DDVP中毒的研究

2.5.1抗毒PR值DDVP染毒小鼠24 h内 LD50±L95为(11.18 ±0.65)mg·kg－1，阿托品 10 mg·kg－1预防后，可使 DDVP的 LD50±L95提高到(20.22±3.07)mg·kg－1，抗毒 PR 值为 1.81，使动物的抗毒效能增加了0.81倍。等剂量宾赛克嗪预防后，可使DDVP的LD50±L95提高到(199.40±16.02)mg·kg－1，抗毒PR值为17.84，使动物的抗毒效能增加了16.84倍，明显高于阿托品。

2.5.2抗DDVP致死作用DDVP 17.00 mg·kg－1染毒后(1.2LD，sc)，10 min 内全部受试动物死亡。阿托品在2.11～37.43 mg·kg－1剂量范围内均可产生一定的抗毒作用;在(3.75～28.07)mg·kg－1剂量范围内可使动物的存活率提高到40% ～60%;剂量高达37.43 mg·kg－1才能完全对抗DDVP的致死作用，ED50±L95为(6.78±3.92)mg·kg－1。宾赛克嗪在 2.11 ～3.75 mg·kg－1剂量范围内，显示良好的抗毒作用，染毒后24 h内30% ～80%的动物存活;宾赛克嗪5.00 mg·kg－1给药就能完全对抗DDVP的致死作用，ED50±L95为(2.87±0.40)mg·kg－1。两药的量效曲线斜率分别为(7.56±1.42)和(1.35±0.38)，P＜0.01，提示两药在抗DDVP中毒的特点上存在明显差异。宾赛克嗪抗毒作用明显强于阿托品与其具有抗M和抗N作用相关(Fig 1F，Tab 3)。

Tab 3 Antidotal efficacy of drugs against DDVP poisoning

3 讨论

ChEI中毒救治的循证医学研究证明，采用WHO推荐的以阿托品和胆碱酯酶复活剂为核心的救治方案并不能进一步提高抢救成功率［1－3］，并且阿托品中毒呈现高发病率和高死亡率，有报道称发病率高达 42.37%［12］，反而增加了死亡率［13］;甚至有研究质疑阿托品使用的有效性［3］。寻找新的特效抗毒剂成为世界防化医学研究的热点。ChEI主要通过抑制胆碱酯酶，引起体内ACh的蓄积，持续激动M和N受体，在中枢表现为震颤、惊厥、昏迷等症状;在外周表现为腺体分泌亢进、气管支气管痉挛等M样中毒症状以及无力、肌颤等N样中毒症状;患者常死于呼吸衰竭、循环衰竭和惊厥。我们的系列研究提示N受体是ChEI中毒救治的重要靶点［4－8］。不论是外周抗M作用强的阿托品还是中枢抗M强的东莨菪碱，其抗毒效果均不理想，主要是因为药物本身无中枢抗N作用。只有具有中枢和外周抗M和N作用的药才有可能发挥更好的抗惊厥、循环衰竭和呼吸衰竭的作用，使抗毒更加全面［8，14－15］。

叔胺类化合物槟榔碱可透过血脑屏障，激动中枢M受体诱发动物震颤。在此模型上，宾赛克嗪对中枢M受体功能的拮抗作用比阿托品强3倍多。虽然前期的实验证明宾赛克嗪对脑组织的亲和力弱于阿托品，但在整体效应上宾赛克嗪的中枢抗M作用却强于阿托品，这可能与其脂溶性强，能迅速透过血脑屏障相关。在烟碱诱发惊厥的模型上，宾赛克嗪对中枢N受体具有较强的拮抗作用，而阿托品无此作用。这表明宾赛克嗪不仅能在中毒早期对抗N受体介导的毒性反应，而且能对抗中毒过程中失敏态N受体对M受体的易化作用，拮抗失敏态N受体介导的毒性效应［4，5－8］。宾赛克嗪对中枢胆碱受体的作用特点是其能够强效对抗ChEI中毒的药理学基础，是其抗毒效果明显优于阿托品的主要原因。

槟榔碱和毛果芸香碱可激动外周M受体使腺体分泌亢进，此模型适用于评价药物对外周M受体功能的影响，具有M受体拮抗作用的药物可阻断上述效应。本研究发现宾赛克嗪可剂量依赖性对抗槟榔碱或毛果芸香碱诱发的小鼠流涎，对外周M受体功能具有拮抗作用，可有效对抗外周M样毒性症状。从作用强度上分析，宾赛克嗪对槟榔碱所致流涎的作用比阿托品稍弱;对毛果芸香碱所致流涎的作用比阿托品弱11倍，这与宾赛克嗪和腺体的亲和力比阿托品低相关。由于阿托品过强的外周抗M作用，才使病人容易出现阿托品中毒［13］;宾赛克嗪对外周M受体作用弱于阿托品是其副作用较少的重要原因。

宾赛克嗪对烟碱诱发回肠收缩的IC50比阿托品强约13倍，表明宾赛克嗪对回肠副交感神经元N受体有拮抗作用。这是因为神经元N受体和平滑肌M受体均参与烟碱诱发回肠收缩，由于宾赛克嗪对M受体激动剂Oxo致回肠平滑肌收缩的抑制作用与阿托品相当，假如宾赛克嗪无抗N作用，是难以解释宾赛克嗪的作用强度比阿托品强一个数量级的。阿托品在大于75 μmol·L－1时可以完全抑制烟碱诱发回肠收缩，这可能与其高浓度时完全拮抗肠平滑肌M受体，使其对内源性ACh激动作用失去反应性而导致肠麻痹有关。

毛果芸香碱和烟碱可同时激动M/N受体，引起全身震颤。此模型可在一定程度上模拟ChEI中毒时体内ACh蓄积［9］。阿托品仅通过其抗M作用来对抗此型震颤;而尽管宾赛克嗪拮抗毛果芸香碱作用弱于阿托品，但是独特的中枢和外周神经元N受体的拮抗作用使得宾赛克嗪对抗此型震颤的强度反而比阿托品强。另外，宾赛克嗪对ACh诱发的离体回肠收缩的拮抗作用与阿托品相当，除了与其抗M受体作用有关外，还与其抗N作用有关。这表明宾赛克嗪能够有效对抗ChEI中毒时ACh引起的全身震颤、流涎、胃肠平滑肌痉挛等M和N样毒性效应，抗毒作用更加全面。

在预防给予同等剂量的宾赛克嗪和阿托品的条件下，宾赛克嗪可使小鼠抗DDVP中毒致死作用的效价大幅提高，明显优于阿托品，再次证明宾赛克嗪对ChEI中毒的强效救治作用。

综上所述，宾赛克嗪独特的拮抗M和N受体功能的特征是其高效对抗胆碱酯酶抑制剂中毒的药理学基础。

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