温针对大鼠腰神经根受压模型中PLA2的影响

谢艳艳,吴耀持

温针对大鼠腰神经根受压模型中PLA2的影响

谢艳艳,吴耀持

(上海交通大学附属第六人民医院,上海 200233)

观察温针对大鼠腰神经根受压模型中PLA2的调节作用。将60只SD大鼠随机分为正常组、模型组、莫比可组、针刺组和温针组,每组12例。除了正常组外,其他各组通过放置硅胶片建立大鼠腰神经根受压模型。正常组不造模不治疗,模型组造模后不治疗,莫比克组、针刺组、温针组的大鼠分别在造模后予以莫比克灌胃、针刺、温针治疗14 d,14 d后所有大鼠麻醉处死取材,运用生化酶标板微孔检测法对每组大鼠受压神经根组织中PLA2进行测定。莫比可、针刺、温针都可以降低大鼠受压腰神经根组织中磷酯酶A2(PLA2)的含量(＜0.01,＜0.05),温针较莫比可和针刺能更明显地降低PLA2含量(＞0.01,＞0.05)。温针可以有效地降低大鼠腰神经根受压模型中的PLA2。

针灸疗法;温针灸;大鼠;椎间盘移位;腰椎间盘突出症

腰椎间盘突出症(LDH)是指在腰椎间盘退变的基础上,纤维环破裂、髓核突出,压迫和刺激神经根、马尾等引起的以腰腿痛、坐骨神经痛为主的综合征[1-6]。本病好发于20～50岁的青壮年,轻者腰腿部不适,重者疼痛剧烈,活动不便,甚者引起马尾损伤综合征,严重影响患者的生活、工作,对社会生产力造成极大的破坏[7-10]。因此,深入开展本病的病因病理学研究,找到有效的防治途径,具有重要的临床价值和社会意义。本实验建立大鼠腰神经根受压模型,观察温针对模型中受压神经根组织中PLA2的调节作用,为温针治疗该病提供实验依据,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂、仪器

选择3月龄清洁级雄性SD大鼠60只,体重为(250±50)g,由上海交通大学附属第六人民医院实验动物中心提供,购自上海中科院;PLA2试剂盒由美国的R&D systems公司(批号514010)提供;MULTISKAN EX型酶标仪由上海龙华医院科技中心提供。

1.2 分组和治疗方案

60只SD大鼠随机分为正常组、模型组、莫比可组、针刺组和温针组,每组12例。正常组不造模,不接受任何治疗和处理,自由饮食摄水14 d;模型组造模后不予治疗,自由饮食摄水14 d;莫比可组造模后予以莫比克(剂量为成人日剂量的30倍)灌胃连续治疗14 d;针刺组造模后予以针刺治疗14 d,采用长25 mm针灸针,取穴受压神经根相应节段右侧的夹脊穴,穴位定位参照林文注主编的《实验针灸学》(上海科学技术出版社出版)有关标准。针刺深度0.5寸,留针20 min;温针组造模后予以温针治疗,采用长25 mm针灸针,针柄上装0.50 cm×1 cm的艾粒1颗,燃烧至灰烬,灸2壮,取穴同针刺组。

1.3 大鼠腰神经根受压模型的建立

手术方法具体操作为,腹腔注射氯胺酮(0.10～0.12 g/kg体重),麻醉满意后,剪毛,固定,消毒,铺无菌巾,以L5-6棘突间隙为中心,取后背正中切口,长约4 cm,切开皮肤,钝性分离椎旁肌,以拉钩牵开,咬出L5-6棘突、右侧椎板和关节突,在手术放大镜下充分暴露右侧L5神经根,将特制的硅胶片[大小4 mm×1 mm×1 mm,重(20±1)mg,先于75%乙醇中消毒3 h,置于0.1%新洁尔灭中保存]置于右侧L5神经根出硬膜囊处,局部固定,牢固,逐层缝合,无菌纱布覆盖,术后大鼠苏醒,放回笼中观察。动物造模后,为确认造模成功,处死2只大鼠进行HE染色观察。详见图1。

图1 正常组与模型组HE染色示意图

HE染色显示,正常组可见神经根形态正常,有髓神经纤维大小基本一致,轴突位于中央,髓鞘位于周围,呈红色网状结构。模型组可见神经纤维周围明显充血、水肿、炎性细胞浸润,神经纤维结构松散,周围神经有髓纤维明显减少,髓鞘广泛节段性脱失,血管扩张。提示造模成功。

1.4 统计学方法

1.5 检测指标及方法

酶的作用是催化底物反应,在底物相对于酶过量的条件下,所有的酶均能与底物结合。本试剂盒使用一种sPLA2的特异性底物,可生成带巯基的结合物,这种巯基产物可以与DTNB(显色剂)反应。用酶标仪在405 nm下,测定显色物的吸光度OD值,根据吸光度OD值反映了底物被水解的量,再根据试剂盒提供的标准品(已知浓度)酶量随浓度改变的曲线(酶浓度曲线),可推算出PLA2的含量。sPLA2Kit组成分为,①酶标孔板96 Well Plate;②sPLA2 Standard(标准品)0.12 mL;③Reaction Buffer(缓冲液)15 mL;④sPLA2 Substrate(底物)2×3 mL;⑤Color Reagent(DTNB,显色剂)3 mL;Stop Solution(终止液)3 mL;⑥Plate Cover(封条)1。

准备全部所需试剂,实验取材样本和标准品梯度分为①样本缓冲液为0.1 MTirs 250 mL加0.1 MHCL 240 mL,调pH值为7.5,加1 mm CaCl21.1 g、Kcl7.4 g、TirtonX-100 7 mL、BSA(小牛血清)1 g,加ddH2O定容至505 mL,4oC贮存。②从－80oC冰箱中迅速取出组织,加样品缓冲液1 mL,冰冻下电动分散器匀浆,4℃离心3500 rpm,15 min,取上清液于离心管中。应用BECKMAN DU800紫外分光光度计进行蛋白定量。③用标准品产生一个浓度梯度,原液(1600m/mL)加入第一支管中。 取出酶标孔板,揭去封条。每个孔中加50mL标准品和样本。每个孔中加100mL反应缓冲液。每个孔中加50mL底物,轻扣板框将其混匀,胶带封盖,37℃孵育30 min。每个孔中加25mL终止液。每个孔中加25mL显色剂,室温下显色10 min。用酶标仪在405 nm下,测定显色物的吸光度OD值,根据吸光度OD值反映了底物被水解的量。详见图2。

图2 标准品浓度梯度示意图

图3 PLA2含量数据计算示意图

PLA2含量数据计算使用ELISA标准曲线拟合的软件CurveExpert1.38。CurveExpert为专用的ELISA数据处理和绘图软件。将实验数据输入软件,自动生成的,X轴代表浓度,Y轴代表OD值,图形与试剂盒要求一致。做出标准图形后,输入样品的OD值,软件就可直接算出样品的浓度。详见图3。

2 结果

正常组PLA2浓度为(14.70±6.70)U/mL,模型组为(43.26±7.45)U/mL,莫比可组为(32.73±7.74)U/mL,针刺组为(28.29±9.60)U/mL,温针组为(19.29±2.02)U/mL。模型组PLA2浓度与正常组比较,差异具有统计学意义(＜0.01),提示造模成功;莫比可组、针刺组和温针组PLA2浓度与模型组比较,差异均具有统计学意义(＜0.01,＜0.05),提示莫比可、针刺和温针均能明显降低PLA2浓度;温针组PLA2浓度与莫比可组比较,差异具有统计学意义(＜0.01),提示温针较莫比可更能明显降低PLA2浓度;温针组PLA2浓度与针刺组比较,差异具有统计学意义(＜0.05),提示温针较针刺能降低PLA2浓度,但是不明显。

3 讨论

腰椎间盘突出症(LDH)的发病机理,目前尚未彻底阐明。公认的学说主要有3种,即机械受压学说、化学性神经根炎学说、自身免疫学说[11-14]。传统的观点认为LDH的机械压迫是引起神经根性疼痛的原因,但不能满意地解释所有的临床和病理现象。近年来的研究越来越表明神经根性疼痛的产生决不仅仅是机械压迫的问题,而是一个相当复杂的病理生理过程。椎间盘组织的降解产物及其通过免疫或非免疫途径产生的生化物质如磷脂酶A2等细胞因子在其中的作用引人注目。

磷脂酶A2(Phospholipase A2,PLA2)是一种脂解酶,能使糖磷脂水解为溶血磷脂、游离脂肪酸和花生四烯酸,而花生四烯酸在脂氧化酶的作用下又可分解为5-脂氧化酶产物如白三烯 A4、B4、D4、E4和环丙过氧化物如PGG2、PGH2,在环氧化酶作用下又可生成前列腺素E2、血栓素A2、B2等,故PLA2不仅是重要的炎症介质和致痛物质,也被认为是局部组织炎症特殊标志[15-24]。Saal等人发现在突出的腰椎间盘中PLA2异常高,髓核标本中PLA2含量超过正常人血浆含量的一万倍,且认为PLA2是炎症反应之启动作用[8]。Ozaktay等[9]将PLA2注入兔子腰小关节囊及附近组织引起急性炎症反应和神经毒性作用。

腰椎间盘突出症的治疗分为手术治疗和保守治疗两方面。针灸治疗是保守治疗中很重要的一种方法。其中针灸治疗腰腿痛历史悠久。在《内经》中有循经选取下肢腧穴的记载,《素问·刺腰痛》:“衡络之脉令人腰痛,不可以俯仰,仰则恐仆(朴),得之举重伤腰。”《医学心悟》中也提到“腰痛拘急,牵引腿足”。

临床上温针比针刺和艾灸治疗该病效果更明显。但温针治疗腰椎间盘突出症的作用途径和机制尚不清楚,因此有必要进行相关研究。本实验通过建立大鼠腰神经根受压模型,分别运用温针、莫比克、针刺对其进行治疗2星期后,运用生化酶标板微孔检测法对大鼠受压腰神经根组织中的PLA2进行测定。结果,温针较针刺、莫比克更能明显减少大鼠受压腰神经根组织中PLA2的含量。

[1] 胡有谷.腰椎间盘突出症[M].第3版,北京:人民卫生出版社,2004: 46.

[2] Mixtter WJ, Barr JS. Rupture of the intervertebral disc with involve- ement of the spinal canal[J]. N England J Med, 1934,211:210-215.

[3] Murphy RW. Nerve roots and spinal nerves in degenerative disc disease[J]. Clin Orthp, 1977,129:46.

[4] Narlor A, Happen F, Turner RL,. Enzyrnic and immunological activity in the intervertebral disc[J]. Orthop Clin North Am, 1975,6: 51.

[5] Eyre DR, Matsui Y, Wu JJ. Collagen polymorphisms of the interver- tebral disc[J]. Biochem Soc Trans, 2002,30:844-848.

[6] Roberts S, Caterson B, Menage J,. Matrix metalloproteinasea and aggrecanase their role in disorders of the human intervertebraldisc[J]. Spine, 2000,25(23):3005-3013.

[7] Ansan R, Tajima N, Chosa E,. Biochemical and morpho- logical changes in herniated human intervertebral disc[J]. Orthop Sci, 2001,6(6):510-518.

[8] Saal JS, Franson RC, Dobrow R,. High levels of inflammatory phospholipase A activity in lumbar disc herniation[J]. Spine, 1990,15: 674-678.

[9] Ozaktay AC, Cavanaugh JM, Blagove DC. Phospholipase A induced eletrophysiologic and histologic changes in rabbit dorsal lumbar spine tissues[J]. Spine, 1995,20:2659-2668.

[10] Chen C, Cavanavgh JM, Ozaktay AC,. Efects of phospholipase on lumbar nerver root structure and function[J]. Spine, 1997,22:1057 -1064.

[11] Willberger RE, Wittenberg RH. Prastagladin release from lumbar disc and facet joint tissue[J]. Spine, 1994,19:2068.

[12] 吴耀持,张彩虹.针刺对腰神经根压迫症模型大鼠受损腰神经根超微结构及炎性介质的影响[J].上海针灸杂志,2003,22(9):32- 34.

[13] Peter J. Biology of intervertebral disc aging and degeneration involvement of extracellulor matrix[J]. Spine, 2004,29(23)2691- 2699.

[14] Joseph chang, Steven C, Gilman, Alan J,. Interleukin-activates phospholipase A2 in rabbit chondroctes: A possible signal for IL-1 action[J]. Journal of Immunity, 1986,136:21-25.

[15] 张艳.磷脂酶A2的调节机制[J].吉林医学,2005,26(12):1374.

[16] Dennis EA. The growing phospholipase A2 superfamily of signal transduction enzymes[J]. Trends Biochem Sci, 1997,22:1.

[17] 陈莉延.磷脂酶A2的研究进展[J].国外医学生理·病理科学与临床分册,2000,20(6):474-475.

[18] Murakami M, Kudo I, Inoue K. Secretory phospholipase A2[J]. Lipid mediators cellssignaling, 1995,12:119-130.

[19] 宓佚群,吴耀持,陈一.温针灸对大鼠腰神经根受压模型炎性介质NOS和CGRP调节作用的研究[J].中国针灸,2009,29(1):48-51.

[20] 张峻峰,吴耀持.腰神经根受压模型大鼠神经根局部炎症因子对温和灸的反应[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,11(45): 9129-9132.

[21] 李振宙,侯树勋,董玲,等.胶原酶对大鼠急性坐骨神经痛模型体内磷脂酶A2活性的影响[J].中国骨肿瘤骨病,2008,7(1):9-13.

[22] 任大江,李放,张志成,等.等离子髓核成形术对兔退变腰椎间盘内磷脂酶A2活性的影响[J].中国脊柱脊髓杂志,2008,18(5):377- 380.

[23] 张益民,姜鑫,郭永智,等.腰椎间盘退变与炎症介质[J].实用骨科杂志,2008,14(9):534-536.

[24] 方小林,黄建林.PLA2在腰椎间盘突出症中作用的研究[J].中医正骨,2007,19(3):73-74.

The Effect of Warm Needling on PLA2 in a Rat Model of Lumbar Nerve Root Compression

-,-.

’,200233,

To Investigate the regulating effect of warm needling on PLA2 in a rat model of lumbar nerve root compression.Sixty SD rats were randomly allocated to normal, model, Mobic, acupuncture and warm needling groups, 12 rats each. A rat model of lumbar nerve root compression was made by placing a silica gel plate in all the groups except the normal group. The normal and model groups were not treated. The Mobic, acupuncture and warm needling groups were treated by Mobic gavage, acupuncture and warm needling, respectively, for 14 days after model making. All the rats were sacrificed by anesthesia to take the compressed nerve root after 14 days. PLA2 in the compressed nerve roots of each group was measured using enzyme label microtiter plate assay.Mobic, acupuncture and warm needling all decreased PLA2 contents in rat compressed lumbar nerve roots (＜0.01,＜0.05). Warm needling decreased PLA2 contents more markedly than Mobic and acupuncture (＜0.01,＜0.05).Warm needling can effectively decrease PLA2 in a rat model of lumbar nerve root compression.

Acupuncture; Warm needling; Rat; Intervertebral disk displacement; Lumbar intervertebral disc herniation

R2-03

A

10.3969/j.issn.1005-0957.2011.09.631

1005-0957(2011)09-0631-03

上海市科委资助课题(04419723)

谢艳艳(1981 - ),女,医师

吴耀持(1961 - ),男,教授,博士生导师,研究方向为腰椎间盘突出症的临床及实验研究,E-mail:wuyaochi@ online.sh.cn

2011-03-13