高质量加工番茄基因组DNA提取方法的改进

张 楠，谢 放

（兰州交通大学化学与生物工程学院，甘肃 兰州 730070）

目前选育高品质植物品种主要采用的是分子标记辅助育种方法，因而怎样获得高质量的基因组DNA用于后续的分子标记将显得非常关键。番茄中含有较多的多糖和其他次生代谢产物（酚、酯、萜、色素等）[1]，这给高质量的DNA提取带来较多的困难。尤其是多糖、色素、蛋白质成分是影响DNA纯度最常见的问题。如何做到在去除污染物又能相对保持高的产量的同时，对大批量的模板进行提取，一直是像番茄这类含多糖、色素和盐类物质较多的植物所探讨的问题。

在加工番茄分子标记辅助育种时，多采用CTAB法[2]、SDS法及DNA试剂盒[3-4]等提取番茄DNA，效果均不太理想。通过试验比较多种提取方法，得到一种适用于提取大批量加工番茄DNA的方法——改进CTAB法。通过此法克服了番茄中富含多糖、蛋白质、酚和色素的影响，所得DNA通过凝胶电泳和分子标记均获得了满意的结果，可以将此方法在富含上述物质的植物中推广使用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

加工番茄叶片于2010年7月采摘于兰州交通大学科技园试验田。将采摘的幼嫩叶片和老叶片分别装入塑料袋置于冰盒中带回实验室，置于-20℃备用。

1.2 药品与试剂

引物序列：随机引物S636（GGGATATCGC），ISSR 引物 855（ACACACACACACACACYT）上述引物由上海生工生物工程公司合成。

CTAB 提取液：含 2%CTAB，1.4 mol/L NaCl，0.2%β-巯基乙醇，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris-HCL pH 值 8.0，PVP，10 mg/mL RNase；TE 缓冲液：含 10 mmol/L Tris-HC1，l mmol/L EDTA（pH 8.0）；饱和酚∶氯仿∶异戊醇（V∶V∶V）=25∶24∶1，氯仿︰异戊醇（V∶V）=24∶1；50×TAE 缓冲液：1 L 缓冲液中含有242.0 g Tris碱，57.1 mL冰乙酸，200 mL 0.5 mol/L EDTA，pH 值 8.0。

1.3 仪器

TGL-20M高速冷冻离心机（湖南湘仪）；紫外分析仪（北京六一仪器厂）；DYY-6C型电泳仪（北京六一仪器厂）；PCR扩增仪（Biometra）；HH-2恒温水浴锅（国华电器有限公司）；UVP凝胶成像系统（USA）。

1.4 DNA的提取

（1）取番茄叶片2～3片放入研钵中，加入液氮，迅速研磨成粉末，称取约0.2 g粉末，快速装入5 mL离心管中；（2）加入850 μL预热CTAB提取缓冲液，65℃水浴40 min，冷却至室温；（3）加入等体积的Tris-饱和酚：氯仿：异戊醇（V25∶V24∶V1）轻震摇匀后，4℃、12 000 g离心 10 min；（4）取上清液，加入10%体积3 mol/L NaAc溶液摇匀后再加入等体积的氯仿-异戊醇（V24∶V1）轻震摇匀后，4℃、12 000 g离心10 min；（5）取上清液，加入2倍体积的冰冻无水乙醇，冰浴20 min，用无菌牙签将絮状物挑出放入新管；（6）70%乙醇（体积分数）漂洗沉淀两次，37℃烘干，溶于60 μL TE缓冲溶液中，4℃保存备用。

1.5 DNA的检测

从提取的DNA液中吸取10 μL，用TE溶液定容至2 000 μL，在紫外分光光度计下测OD260，OD280值，并计算OD260/OD280，跟据公式 [DNA浓度（μg/mL）=50×OD260×稀释倍数）]计算 DNA 浓度；称取0.2 g琼脂糖加人25 mL的1×TAE缓冲液，经微波炉加热溶解，待其不烫手时加入0.2 μL EB（10 mg/mL）即用含EB的0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定提取的 DNA，每孔点样 4 μL（3 μL DNA 样品+1 μL 上样缓冲液），电压80V，电泳40 min。

1.6 PCR扩增

采用25 μL扩增体系，以随机引物S636和ISSR引物855分别作为单引物，随机扩增体系组成参见杨永超等[5]的方法，ISSR扩增体系参见朱为民等[6]的方法。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，5 V/cm，1 h。

2 结果与分析

2.1 DNA溶液吸光值、浓度及电泳检测

当OD260/OD280值在1.7～1.9时说明所提取的DNA质量较好，比值小于1.7可能有蛋白污染，比值大于2.0，说明有RNA污染或DNA已经降解。幼嫩叶片和老叶片所提取DNA溶液经紫外分光光度计测定260 nm和280 nm处的吸光值并计算OD260/OD280，其值在1.75～1.91之间，计算得DNA浓度为在40～80 ng/L，并结合电泳图谱得出所提DNA纯度较高，RNA和蛋白质含量较少，无降解，根据计算将DNA浓度调整为20 ng/μL，于－20℃贮存备用。

图1 总DNA电泳检测

2.2 PCR扩增结果

采用RAPD随机引物和ISSR引物对随机提取的两个老幼叶片的DNA模版进行PCR扩增然后进行电泳检测（图2、图3）。从结果来看采用两种分子标记均能扩增出清晰、无拖尾的电泳图谱，说明用此法所提取的加工番茄DNA在结构上具有完整性；加样口无亮带，说明所得的DNA溶液较纯，无其他糖类、酚类、色素等杂质，适合RAPD和ISSR等分子标记试验。

图2 用RAPD引物对DNA模板质量进行PCR扩增检测

图3 用ISSR引物对DNA模板质量进行PCR扩增检测

3 讨论

植物组织在生长中随着生长阶段的不同所富含的多糖、酚类和色素含量各不相同[1]。本研究通过提取出番茄幼嫩叶片和老叶片中的DNA经紫外、电泳和PCR扩增检验表明纯度高、无杂质存留，DNA片段完整，不需进一步纯化即可用于分子标记试验。本法与以往的提取方法相比，具有以下特点：第一，采用冷藏和液氮研磨的方式最大程度的避免了叶片细胞中DNA的降解，保证了所提DNA的质量和片段的完整性。第二，在提取缓冲液中加入防止酚类氧化与易与酚类结合的试剂β-巯基乙醇和PVP（聚乙烯吡咯酮），防止了酚类与DNA的结合。第三，采用tris-饱和酚-氯仿-异戊醇，氯仿-异戊醇相结合的抽提法更有效地去除了蛋白质和酚类的残留。第四，通过加入3 mol/L NaAc能明显溶解脂溶性色素和多糖，随后经冰冻无水乙醇沉降和70%乙醇多次洗涤能有效达纯化DAN的目的。同时，应用此法也成功提取了西瓜和甜瓜的DNA。此外，可采用老叶片进行DNA的提取，本法对于在植物分子标记辅助育种过程中获得种子很少的品种，解决了传统方法通过黄化苗和幼苗提取DNA所面临材料短缺的问题。

[1] 霍 锋，张 泷，张 娅.DNA分子标记技术在药用植物鉴别中的应用[J].安徽农业科学，2010，（8）：4089-4091.

[2] 路 盼，康立功，许向阳，等.3个番茄品种及其6份亲本材料指纹图谱的构建[J].中国瓜菜，2010，23（3）：6-10.

[3] 高永利，李景富，王傲雪，等.番茄RAPD反应体系的优化[J].东北农业大学学报，2007，38（2）：175-180.

[4] 董坦坦，姬长英，周 俊，等.成熟番茄的图像识别及其位姿的获取研究[J].江西农业学报，2009，21（8）：152-155.

[5] 邓正春，肖清平，覃事玉，等.影响番茄杂交制种产量的因素分析[J].湖南农业科学，2010，（7）：21-22，25.

[6] 朱为民，王曙霞，杨少军，等.番茄ISSR-PCR反应体系的优化[J].上海农业学报，2007，23（3）：5-8.