印度洋深海沉积物中酵母菌IR08的分离与鉴定

赵昌会 ，孙 佳 ，黄翔玲

（1.湖南科技学院，湖南 永州 425100；2.国家海洋局第三海洋研究所，福建 厦门 361005；3.国家海洋局海洋生物遗传资源重点实验室，福建 厦门 361005）

海洋中酵母菌的含量比较低，一般情况下，远海的水体中酵母菌的浓度低于10 cells/dm3，而污染的沉积物中为100 cells/g以上，底质中酵母菌的含量受沉积物类型的影响比较大[1]。可通过浓缩水样或加富培养来分离酵母菌，但对于含量较少、生长较慢的酵母菌株，则需要运用特殊的富集法分离[2]。实验室环境与自然环境的差异，加上采样的困难，限制了人们对深海酵母菌的研究。Nagahama等[3－6]从1 000～11 000 m的深海样品中分离到多种酵母菌，其中一些菌株与已知菌株同源性差异较大，具有研发的新潜力。本文对分离自印度洋中脊底质的深海酵母IR08进行了研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 菌株IR08由黄翔玲同志采用PDA培养基从印度洋 IR-T3C1站（31.0877°S、59.1124°E）水深4 051 m 的洋底0～3 cm层底质样品中分离获得。

1.1.2 培养基 PDA培养基：马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂1.5%、pH 7.0（深海海水配制）；同化碳源基础培养基：MgSO4·7H2O 0.05%、酵母膏 0.02%、（NH4）2SO40.5%、KH2PO40.1%（3.4%（W/V）NaCl溶液配制）。

1.2 方法

1.2.1 深海酵母的显微镜观察 挑取少量的新鲜酵母菌混匀于载玻片的无菌水中，盖上盖玻片，油镜下观察。

1.2.2 深海酵母菌的温度和盐度试验 用接种环挑取少量的酵母接于盐度分别为0、24、34、100的液体培养基中，分别在 4、10、25、35℃下培养（以不加菌液为对照），每隔24 h观察培养液混浊度的变化。

1.2.3 深海酵母菌的碳代谢试验 用接种环挑取少量酵母菌稀释于碳源利用鉴定液体基础培养基中，混匀，取0.4 cm3加到TH04酵母样真菌鉴定板上（杭州微生物试剂有限公司），35℃摇床培养5 d（100 r/min）。

1.2.4 深海酵母菌DNA的提取与扩增 以酵母染色体DNA的提取为参考[7]。

1.2.5 深海酵母菌IR8的鉴定 菌株的染色体DNA 采用特异引物[8]ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCG TAACAAGG-3′和 LR6：5′-CGCCAGTTCTGCTTA-3′，扩增26S rDNA的D1/D2区及ITS区在内的一段核糖体DNA。其PCR扩增反应系统中包括：DNA模板 50 ng、正向及反向引物（各 10-5mol）、Taq DNA聚合酶（4 U）、2.5 mmol/μdm3的 dNTP 5 μL、5 μL 的10×PCR 缓冲液、DDW 补至 50 μL，26S rRNA 基因扩增程序：95℃预热 4 min，94℃变性 1 min、52℃退火1 min、72℃延伸2 min，36个循环，最后 72℃ 10 min。对扩增的26S rDNA片段直接测序，测序引物选用F63、LR3；返回结果通过DNAMAN软件处理，以此为对比目标，通过FASTA网上分析搜索EMBL数据库，寻找同源性最高菌株，采用邻接法[7]构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 IR08的菌落和菌体形态

IR08菌落淡红色，圆形突起，较湿润，直径1～2 mm，易挑取。细胞卵圆形，单端芽殖（如图1）。

图1 IR08的细胞形态（100×）

2.2 不同温度和盐度对IR08生长的影响

IR08菌株受盐度的影响较小，在25～35℃生长良好，10℃以下生长缓慢（如表1）。

表1 酵母IR08在不同时间、盐度和温度下的生长状况

2.3 IR08的碳源利用特征

IR08除了能利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖及半乳糖外，还能利用尿素、纤维二糖、阿拉伯糖、棉子糖、肌醇和、松二糖、山梨醇等，但不能利用木醇、海藻糖、肌醇、木糖。

2.4 IR08菌株的鉴定

将26S rDNA的D1/D2区的序列测序，输入到EMBL数据库对比，得到rDNA分子同源性相似度最高为 Pichia guilliermondii-AY188372（98.8%），构建的系统发育树如图2。

图2 IR08的系统发育树

3 讨论

酵母的鉴定主要借助于生理学特征，但其碳和氮的同化实验常表现易变或区别不明显，如红酵母属、掷孢酵母属、木森顿酵母属、锁掷孢酵母属等，需用ITS和5.8S DNA基因序列测定、18S rDNA及26S rDNA的转录间隔区的基因序列[1]，这为发现新种提供了良好的途径。如Nagahama在深海底质中发现新种[6]。

季也蒙毕赤酵母能在含铬量较高的条件下生长，并将其吸收[9]、也可富集重金属铜[10]及防治果实产后的腐烂[11]；分离自海洋的季也蒙毕赤酵母具有高产菊粉酶[12]等活性，深海分离的酵母菌IR08在环境修复及果实防腐等方面的价值有待于研究开发。致谢：

本研究在国家海洋局第三海洋研究所叶德赞研究员的实验室完成，对他在本研究中的指导和支持，谨致谢忱！

[1] Nagahama T.Yeast biodiversity in freshwater，marine and deepsea environments（Biodiversity and Ecophysiology of Yeasts）[J].Springer，2006，（3）:242-262.

[2] Yanagida F，Kodama K，Shinohara T.Selection of marine yeast stock for making white wine[J].J Brew Soc Jpn，2002，97:150-161.

[3] Nagahama T，Hamamoto M，Nakase T，et al.Kluyveromyces nonfermentans sp.nov.，a new yeast species isolated from the deep sea[J].Int J Syst Bacteriol，1999，49:1899-1905.

[4] Nagahama T，Hamamoto M，Nakase T，et al.Distribution and identification of red yeasts in deep-sea environments around the northwest Pacific Ocean[J].Antonie Van Leeuwenhoek，2001，80:101-110.

[5] Nagahama T，Hamamoto M，Nakase T，et al.Cryptococcus surugaensis sp.nov.，a novel yeast species from sediment collected on the deep-sea floor of Suruga Bay [J].Int J Syst Evol Microbiol，2003，53:2095-2098.

[6] Nagahama T，Hamamoto M，Horikoshi K.Rhodotorula pacifica sp.nov.，a novel yeast species from sediment collected on the deepsea floor of the north-west Pacific Ocean[J].Int J Syst Evol Microbiol，2006，56:295-299.

[7] 骆祝华，王祥敏，黄翔玲，等.热带太平洋深海酵母菌的多样性与碳代谢特征研究.第三届海洋生物高技术论坛 [C].2005：417-423.

[8] Fell J W，Boekhout T，Fonseca A，et al.Biodiversity and systematics of basidiomycetous yeasts as determined by large-subunit rDNA D1/D2 domain sequence analysis[J].Int J Syst Evol Microbiol，2001，50:1351-1371.

[9] Ksheminska H，Jaglarz A，Fedorovych，et al.Bioremediation of chromium by the yeast Pichia guilliermondii:toxicity and accumulation of Cr（III）and Cr（VI）and the influence of riboflavin on Cr tolerance[J].Microbiological Research，2003，158（1）:59-67.

[10] María-Isabel S，Luz B，Cristina A，et al.Feasibility of copper uptake by the yeast Pichia guilliermondii isolated from sewage sludge[J].Research in Microbiology，2002，153:173-180.

[11] Yan Z，Kang T，Sicong T，et al.A combination of heat treatment and Pichia guilliermondii prevents cherry tomato spoilage by fungi[J].International Journal of Food Microbiology，2010，137:106-100.

[12] Xinjun Y，Ning G，Zhenming C，et al.Inulinase overproduction by a mutant of the marine yeast Pichia guilliermondii using surface response methodology and inulin hydrolysis[J].Biochemical Engineering Journal，2009，43（3）:266-271.