具长效性重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白的理化特性研究

富岩，韩国，富俞淞，杨小楠，邢静，于在林

人粒细胞刺激因子又称人粒细胞集落刺激因子（human granulocyte colony-stimulating factor，hGCSF）是一种多肽细胞生长因子，可特异地作用于粒系造血祖细胞，调节粒细胞的增殖与分化，增强粒系终末分化细胞的功能和增加成熟粒细胞的产出[1-2]。hGCSF 还是一种调节造血干细胞复制、增殖、分化以及增强嗜中性粒细胞趋化、吞噬功能的小分子多肽。重组人粒细胞刺激因子（rhGCSF）在临床上成功地用于抗肿瘤放化疗后粒细胞减少症及感染的治疗[3]。在许多体内外实验中都显示了GCSF 对中性粒细胞、单核-巨噬细胞、淋巴细胞等免疫细胞的数量和功能有正向调节作用。临床研究发现，rhGCSF 除了应用在肿瘤患者放化疗后的粒细胞低下症的治疗外，还可明显改善术后并发重症感染患者的单核细胞功能缺陷，使其增加 TNF-α 的分泌和上调 HLA-DR 分子的表达，并通过增加淋巴细胞数量、调节 T 细胞的增殖分化、增强 Th1 的免疫活性（IL-2、干扰素分泌增多）等，逆转了适应性免疫细胞的低应答状态。rhGCSF 可改善免疫细胞的活性，为临床外科防治术后感染提供了有力的依据。由于 rhGCSF 的血液半衰期仅有 3.5 h，患者需要每天 1～2 次频繁给药[4]。利用 PEG 化学修饰法对 rhGCSF 进行加工，可以使得 rhGCSF 长效化[5]。但是在常规的原液（成品）基础上再加工，修饰得率不高，生产成本是常规药的 20～60 倍，临床用药剂量又较常规 rhGCSF 的最大使用剂量由 300 µg/次提高到 6000 µg/次，是常规 rhGCSF剂量的 20 倍[6]。因此，寻找新的 hGCSF 长效化方法一直在继续。

人血清白蛋白（HSA）是一种可溶性的球状非糖基化蛋白质，理论分子量为66471.35 D，含有585 个氨基酸和 17 对二硫键。每升人血液中含有50 g 血清白蛋白，是人体血液中蛋白质总量的一半以上。作为血液中的最主要和最基本的载体蛋白，其可携带和传递多肽分子、脂肪酸、类固醇和激素等小分子重要物质。白蛋白稳定的惰性也是维持血压的一个重要因素；同时白蛋白在血液中的半衰期约为14～20 d 左右[7]。利用白蛋白可抵御生物体内酶解作用的优势，在与治疗性蛋白质形成融合蛋白后，就使得治疗性蛋白质的半衰期获得大大延长。1992年，Yeh 等[8]首次提出了利用酵母分泌的白蛋白/CD4 融合蛋白用于人类疾病的治疗设想。对人血清白蛋白与治疗性蛋白质所形成的融合蛋白所进行研究，展示了一个新的蛋白质药物长效化的技术方法。本课题组十余年来已开展对多种血细胞刺激因子、干扰素、白介素及各种皮肤细胞生长因子与白蛋白形成融合蛋白，作为长效药物的可能性开展研究，获得了海量的研究资料，部分结果已公开[9-14]。其他课题组例如：Halpern 等[15]对人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白 Albugranin 开展的动物试验；Osborn 等[16]对人血清白蛋白与干扰素 α2b 融合蛋白（Albuinterferon）在猴体内开展的药代/药动（PK/PD）试验研究结果，都显示不同的人血清白蛋白融合蛋白在动物体内均具有比常规重组蛋白质药物更长的体内半衰期特性。融合蛋白 Albuinterferon和 Albugranin 是由酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）表达和制备，而本课题组的融合蛋白是由毕赤酵母菌（Pichia pastoris）表达制备的。融合蛋白的理化特性研究除了重组人血清白蛋白/干扰素 α2b 融合蛋白有部分较为详细的报道外[17-18]，其他融合蛋白的理化特性均未见报道。

本文首次报道了由重组毕赤酵母（Pichia pastoris）工程菌表达，经过分离纯化工艺获得的rHSA/GCSF 理化特性所展开的分析工作。研究获得的数据对理解人血清白蛋白融合蛋白的蛋白质特性、融合蛋白形成体内长效性提供分子结构的基础性证明，对同类融合蛋白研究也提供了启示作用。这些研究结果也作为《注射用重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白》的质量标准检定指标，用于指导今后临床用药的生产质量控制标准，具有实际应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 本研究中使用的化学试剂均为分析纯或药用级；限制性内切酶、DNA 连接酶、聚合酶、胰蛋白酶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、DNA和蛋白质分子量标准品等均购自美国 Promaga 公司；常规无机盐培养基购自美国 Invitrogen 公司；分离纯化介质填料均来自美国 GE Healthcare 公司；两性电解质购自美国 Ampholyte 公司；等电点标准品购自美国 Bio-Rad 公司；人血清白蛋白特异鼠单克隆抗体购自美国 Sigma 公司，特异识别人粒细胞刺激因子的鼠单克隆抗体则购自美国 R&D System 公司；重组人粒细胞刺激因子生物学活性测定标准品购自中国药品生物制品检定所；毕赤酵母菌宿主蛋白检测试剂盒为美国 Cygnus 公司产品；Dig-DNA 标记试剂盒为美国 Roche 公司；改进型Lowry蛋白含量检测试剂盒为美国 Pierce 公司产品；细菌内毒素检测鲎试剂为中国湛江安度斯生物有限公司产品；糖蛋白染色试剂盒为美国 Thermo公司产品。

1.1.2 仪器 LC-10Avp Plus 高效液相色谱仪为日本岛津公司产品；TSK-GEL G2000SWXL（7.8mm×300mm）色谱柱购自日本 TOSOH 公司；十八烷基硅烷键合硅胶填充柱购自美国 Agilent 公司（C-18）或天津博纳艾杰尔科技公司（Venusil ASB C-18）；气相色谱仪（Agilent 6890N）和火焰离子化检测器（FID）为美国 Agilent 公司产品；电泳仪为Bio-Rad 公司产品；全自动控制 200 L 发酵罐系统为中国江苏镇江东方生工公司。

1.2 方法

1.2.1 rHSA/GCSF 的工程表达菌株的构建 采用常规的基因克隆和 PCR 技术，人血清白蛋白基因和人粒细胞刺激因子成熟肽基因片段分别克隆自人胎肝全 RNA 转录的 cDNA 文库。PCR 扩增的GCSF 成熟肽 DNA 片段插入到带有分泌肽的人血清白蛋白基因全 DNA 序列的毕赤酵母菌转移质粒pAO815-HSA[21]的 Bsu36I 和该质粒 DNA 上的XhoI 限制性内切酶位点之间。人粒细胞刺激因子成熟肽的 N 端与人血清白蛋白成熟肽的 C 端之间直接基因融合，获得 pAO815-HSA/GCSF 转移质粒。含有全融合蛋白基因序列的转移质粒，通过电脉冲转导与毕赤酵母菌 GS115 菌株上 DNA 同源序列间发生重组，将转移质粒中的表达组盒重组在酵母菌染色体上。具体 DNA 克隆程序和所用的合成HSA 和 hGCSF 的 DNA 引物序列参见文献[9]。融合蛋白基因表达启动子是酵母菌的乙醇氧化酶（AOX1）。当使用甲醇作为唯一酵母菌生长碳源，也就同时启动了融合蛋白的表达和生产。融合蛋白被直接分泌到酵母菌体外培养液中。

1.2.2 rHSA/GCSF 工程菌种子库建立和发酵工艺 高效表达 rHSA/GCSF 融合蛋白的毕赤酵母工程菌按《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2005 版三部《生物制品生产检定用菌毒种管理规程》的要求制备主种子库和工作种子库。菌种稳定性经连续传代 30 次，验证目的蛋白的表达水平变化。随机选取工程菌菌落 50 个，采用 PCR 方法验证，目的蛋白基因序列是否有阳性反应。发酵生产采用全自动控制 200 L 发酵罐系统。工作种子经二级种子培养扩增后（总用时约 36 h），接种于200 L 发酵罐中，采用常规无机盐培养基或本实验室改进优化的无机盐培养基进行酵母菌菌体的生长和扩增（约 24 h），待菌体湿重达到 350～400 g/L时启动甲醇流加，进入融合蛋白的诱导生产阶段（约72 h），甲醇和溶氧浓度均控制在适当数值条件。发酵工艺基本参照文献[21]进行。

1.2.3 rHSA/GCSF 的分离纯化工艺 150 L 含有融合蛋白的发酵液经板框过滤或连续流离心机将上清液和菌体分离。上清液经 0.22 µm 滤芯除去不溶物和颗粒状物质后，利用蠕动泵将含融合蛋白的上清液，直接上经平衡液（25mmol/L NaAc，pH 5.0）平衡的含 Capto-MMC 介质的层析柱，上样后用平衡液再平衡；使用缓冲液（50mmol/L PB，pH 7.0）将杂蛋白洗脱，缓冲液（50mmol/L PB，pH 7.0，0.6 mol/L NH4Cl）将融合蛋白洗脱，纯度达 80%以上；融合蛋白可进一步经 Butyl-SepharoseTM4 FF作为配基的疏水性介质（HIC）纯化，使之纯度达95%以上。融合蛋白再进一步经离子交换层析填料做进一步精纯，最后经 G25 介质填料脱盐，获得纯度达 98%以上的融合蛋白，作为注射用重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白原料药（原液）。rHSA/GCSF 的分离纯化工艺基本参照文献[19]。原液的蛋白含量测定采用《中国药典》2005版三部[22]，附录 VIB 蛋白质测定法第二法 Lowry 法进行测定。原液中的细菌内毒素测定采用文献[22]附录XIIE 细菌内毒素检查法中的凝胶法，检测细菌内毒素试剂盒的鲎试剂标定灵敏度为0.25 EU/ml。

1.2.4 rHSA/GCSF 免疫学鉴别 纯化制备的rHSA/GCSF 按文献[22]附录 VIIIA 免疫印迹法和VIIIB 免疫斑点法进行两种抗体的分别鉴别，人血清白蛋白特异鼠单克隆抗体和特异识别人粒细胞刺激因子的鼠单克隆抗体第一抗体稀释比为300～1000 倍；第二抗体（荧光标记抗体）的使用则按生产单位操作说明书执行。

1.2.5 rHSA/GCSF 的体外细胞学生物活性测定 rHSA/GCSF 的体外细胞学生物活性测定采用NFS-60 细胞/MTT 比色法，按 Shirafuji 等[23]提供的方法进行测定。

1.2.6 rHSA/GCSF 物理特性

1.2.6.1 rHSA/GCSF 纯度分析

1.2.6.1.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDSPAGE） rHSA/GCSF 原液的电泳纯度测定采用还原型或非还原型 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行测定。分离胶浓度为7.5%，每个泳道上样量应不低于 10 µg（考马斯亮蓝 R250 染色），对电泳结果用扫描仪成像，应用分析软件分析各条带的百分比，计算目的蛋白所占百分比。

1.2.6.1.2 高效液相法（RP-HPLC 和 SECHPLC） 采用十八烷基硅烷键合硅胶填充柱，以 A相（三氟乙酸-水溶液：取 1.0 ml 三氟乙酸加水至1000 ml，充分混匀）、B 相（三氟乙酸-乙腈溶液：取 1.0 ml 三氟乙酸加乙腈至 1000 ml，充分混匀）为流动相，在室温条件下，进行梯度洗脱（20%～70%B 相，适宜时长）。上样量不低于 10 µg，检测波长为214 和 280 nm 双波长。以 rHSA/GCSF 色谱峰计算理论塔板数应不低于 1500。按面积按归一化法计算，rHSA/GCSF 峰面积要求不低于总面积的95.0%。rHSA/GCSF 原液经缓冲液置换后，采用常规的凝胶分子排阻-高效液相法（SEC- HPLC）进行纯度测定，方法与 RP-HPLC 方法相同。

1.2.6.2 rHSA/GCSF 分子量测定

1.2.6.2.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 采用还原型 SDS-PAGE 测定 rHSA/GCSF 分子量，分离胶浓度为10%，上样量为1 µg。经考马斯亮蓝 R250染色，用扫描仪对电泳结果成像，应用分析软件计算已知分子量标准品各条带的相对迁移率距离制作直线回归，根据目的蛋白迁移率距离带入直线回归方程计算出 rHSA/GCSF 分子量。

1.2.6.2.2 激光质谱法 rHSA/GCSF 的质谱分子量是由北京国家生化药物测试中心承担。检测条件：N2激光源，波长 337 nm；检测方式：正离子，线性方式（飞行管长 1.5 m，加速电压 20 kV），基质：SA。与 rHSA/GCSF 氨基酸序列的理论分子量进行比较。

1.2.6.3 圆二色光谱分析 远紫外区圆二色 CD光谱主要反映肽键的圆二色性，辨识蛋白质的二级和三级结构。rHSA/GCSF的圆二色光谱测定工作由中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点研究室承担。

1.2.6.4 甲醇和甘油残留量测定 rHSA/GCSF 的发酵生产制备过程中使用的培养基中含有甘油作为碳源。理论上，甘油在酵母菌生长和扩增过程中完全消耗后才转为使用甲醇作为碳源和重组融合蛋白的表达诱导剂。为了用药完全，有必要对 rHSA/GCSF 原液样品中的甘油和甲醇残留量进行检测。气相色谱仪和火焰离子化检测器（FID）用于甘油和甲醇检测，方法为毛细管柱顶空进样等温法[24-25]，以不同量甲醇或甘油作为标准品参照，每个量点连续进样 2 次，测量参照标准品溶液的峰面积，记录色谱图。待测样品则按相同方法进样和测定，根据用标准品制备的曲线，计算出待测样品中的甘油或甲醇含量（残留量）。甲醇的残留量测定也采用了变色酸比色法[26]进行比较。

1.2.6.5 宿主蛋白和外源性 DNA 残留量测定 使用毕赤酵母菌进行 rHSA/GCSF 的生产和制备，在纯化的原料药中含有多少宿主蛋白质和外源性 DNA（杂质）是需要确定的，以保证在临床用药时，这些残存的宿主物质不会带来临床上的异源蛋白刺激反应。毕赤酵母菌的宿主蛋白质残留量测定，操作方法参照厂家提供的说明书进行。毕赤酵母菌的宿主 DNA 残留量测定，采用自制提取毕赤酵母菌总DNA，利用 Dig-DNA标记试剂盒制备毕赤酵母菌的总 DNA 探针。rHSA/GCSF 原液中残留的外源性DNA 经变性为单链 DNA 吸附于固相膜上，在一定温度下与相匹配的单链 DNA 探针标记复性而杂交结合为双链 DNA，并使用相应的显示系统显示杂交结果，与已知含量的阳性 DNA 对照比对后，给出待测原液中的宿主 DNA 残留量数值。

1.2.7 rHSA/GCSF 化学特性

1.2.7.1 N 端氨基酸序列分析 rHSA/GCSF 的N 端前 15 个氨基酸序列测定由北京大学生命科学学院按 Edman 降解法进行测定。适量 rHSA/GCSF原液样品对纯水充分透析，转移至经预处理的 PVDF膜上，干燥后直接在蛋白质 N 端氨基酸测序仪按标准测定方法，测定 rHSA/GCSF 的前 15 个氨基酸的序列。

1.2.7.2 等电点分析 rHSA/GCSF 的等电点测定采用常规的等电聚焦垂直板电泳法测定。根据标准品的等电点（pI）对其相应的迁移率距离作直线回归，将 rHSA/GCSF 的迁移距离代入直线回归方程，求出待测样品的等电点。

1.2.7.3 糖基化分析 rHSA/GCSF 原液和糖蛋白阳性对照品辣根过氧化物酶糖蛋白和重组人促红细胞生成素（rhEPO）、糖蛋白阴性对照品大豆胰蛋白酶抑制因子一起进行 SDS-PAGE 分离，进行糖蛋白染色的电泳胶在扫描仪上扫描，再用考马斯亮蓝R250 复染，扫描成像。

1.2.7.4 紫外光谱测定 rHSA/GCSF 的紫外光谱测定以 10mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH 5.5）为空白对照液，在常规紫外可见分光光度计上对rHSA/GCSF 原液稀释样品（用空白对照液稀释至0.1 mg/ml）进行 450～260 nm 波长的连续扫描，测定其最大吸收峰波长。

1.2.7.5 自由巯基测定 自由巯基测定采用质谱分子量测定方法，由北京蛋白质组研究中心进行测定。将经烷基化处理封闭自由巯基和未经处理的同一来源 rHSA/GCSF 原液按 1.2.6.2.2 中描述的质谱分子量测定方法进行比较，每一个烷基的分子量为57 D。

1.2.7.6 肽图谱（RP-HPLC 法和肽质量指纹质谱法）

1.2.7.6.1 胰蛋白酶裂解-反相高效液相色谱法 取rHSA/GCSF 原液稀释至浓度为1 mg/ml，用 1%碳酸氢铵溶液充分透析，以终浓度 0.01 mol/L 二硫苏糖醇（DTT）在 56℃下还原 60min，以终浓度0.055 mol/L 碘乙酰胺室温避光烷基化 30min，按1∶50（mg/mg）加入胰蛋白酶溶液[取甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮处理过的（或序列分析纯）胰蛋白酶适量，加 1%碳酸氢铵溶液溶解，制成浓度为0.1 mg/ml的溶液]到供试品溶液中，在 37℃保温 24 h 后，按 1∶10 加入 50%醋酸溶液，以 10 000 r/min 离心 5min（或通过 0.45 µm 膜过滤），精密量取上清液 100 µl，注入高效液相色谱仪，通过辛烷基硅烷键合硅胶或十八烷基硅烷键合硅胶柱进行梯度洗脱，流动相及洗脱程序为A 液为0.1%三氟乙酸-水溶液，B 液为0.1%三氟乙酸-乙腈溶液。以流速为1 ml/min，梯度洗脱 70min（A 液从 100%～30%，B 液从 0～70%），检测波长为214 nm 记录色谱图。

1.2.7.6.2 激光质谱肽质量指纹图谱的测定 使用基质辅助激光解吸附电离飞行时间串联质谱仪进行检测，由北京蛋白质组研究中心承担。取待测样品 10 µl，加入 10 µl 100mmol/L NH4HCO3溶液，加入 100mmol/L DTT 至终浓度 10mmol/L，56℃反应 1 h。冷却至室温后，加入 250mmol/L IAA 至终浓度 25mmol/L，避光反应 1 h。加入 0.5 µg Trypsin，37℃反应 12 h。将上述酶切产物与基质按 1∶3 混合点于靶上，自然晾干后，反射正离子模式（扫描范围 m/z 500～5 000）和线性正离子模式（扫描范围 m/z 3 000～20 000）下测定肽质量指纹谱（PMF），以已知 rHSA/GCSF 氨基酸序列肽段分子量进行比对。

2 结果

2.1 rHSA/GCSF 工程菌的构建和表达产物

利用基因工程技术构建的毕赤酵母工程菌种表达重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白（rHSA/GCSF）成熟肽的理论氨基酸序列见图1。分泌到发酵液中的融合蛋白是可溶性的蛋白质，具有 759 个氨基酸，rHSA/GCSF 的理论计算分子量为85215 D，等电点（pI）5.799；共有 19 个二硫键，分别为53-62，75-91，90-101，124-169，168-177，200-246，245-253，265-279，278-289，316-361，360-369，392-438，437-448，461-477，476-487，514-559，558-567，621-627（34hGCSF42），649-659（64hGCSF74）。HSA 的第34 个半胱氨酸（C）有一个游离的自由巯基。第602 位（在 hGCSF 氨基酸序列的第17 位）的半胱氨酸（C）也有一个游离自由巯基。

图1 重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白（rHSA/GCSF）成熟肽氨基酸序列Figure 1 The amino acid sequences of mature peptide of recombinant human serum albumin/granulocyte colonystimulating factor fusion protein (rHSA/GCSF)

2.2 rHSA/GCSF 的大规模发酵工艺的建立

对表达 rHSA/GCSF 的工程菌进行主种子库和工作种子库的建立和检定使之符合国家对生物制品生产用菌种的要求。随机选取 50 个工程菌菌落，进行目的基因 PCR 检测，为100%阳性。酵母重组工程菌经连续 30 个代次的传代，目的蛋白表达水平稳定，与原始菌种相同。采用 5 L、30 L 和 200 L不同规模的发酵系统进行工程菌的发酵测试和优化，确定了 rHSA/GCSF 毕赤酵母工程菌在 200 L规模的发酵工艺。工程菌经二级种子阶段培养扩增后，在 200 L 生产罐中再扩增至菌体湿重达 350～400 g/L 时，启动甲醇添加，连续灌注甲醇 72 h，结束融合蛋白的诱导和生产。融合蛋白分泌到酵母细胞外的培养液中，取不同时间诱导时的发酵上清液 20 μl 进行还原和非还原（图2，泳道 4）的SDS-PAGE 分析结果显示，72 h 时发酵上清液中总蛋白（不低于 1 g）的 40%是 rHSA/GCSF 单体融合蛋白目的产物（图2）。从不同时间的诱导表达结果可以看出，随着时间的延长，酵母菌分泌的目的蛋白获得积累，增加上清液中的融合蛋白含量。同时，观察表明目的蛋白表达产物（rHSA/ GCSF）也还是有被降解和形成聚合体的现象存在。融合蛋白的降解物存在，会对目的蛋白的分离纯化有直接影响。因为目的蛋白降解物是和目的蛋白具有相同的肽段，亲和层析介质和疏水介质（HIC）在特异结合目的蛋白时会受到竞争性结合影响。为此，虽然延长生长时间，单位产量会有巨大的增加，但是可能会为下游的纯化带来困难，因此限定诱导 72 h 左右时结束诱导，进入融合蛋白的分离纯化程序。可以确定毕赤酵母工程菌株的 rHSA/GCSF 表达水平不低于 300 mg/L（72 h），发酵工艺可线性放大、无机盐培养基组分简单、成本低廉可满足今后产业化的要求。

图2 在 200 L 发酵罐中毕赤酵母工程菌经甲醇诱导表达重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白（rHSA/GCSF）Figure 2 The rHSA/GCSF expression by methanol induced from a genetically engineered Pichia pastoris strain in a 200 L bio-reactor (fermenter)

2.3 rHSA/GCSF 蛋白质分离纯化

图3 显示出融合蛋白从发酵上清液，经上述3 个分离纯化步骤，逐步纯化的过程，也展示出为达到分离纯化的目的，每个介质填料的分离功能。精纯获得的 rHSA/GCSF 溶液，按改进型 Lowry法测定，蛋白质含量在 5 mg/ml 左右，细菌内毒素含量在 1 EU/ml 以下。制备的 rHSA/GCSF 溶液符合生物制品要求的纯度，可以作为《注射用重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白》的原料药（原液）。

图3 从发酵上清液中经三种介质层析分离纯化的 rHSA/GCSF 融合蛋白Figure 3 rHSA/GCSF was purified from the fermentation supernatant through a three-step chromatography

2.4 rHSA/GCSF 免疫鉴别

rHSA/GCSF 是由两个蛋白质分子融合组成的，通过免疫印迹试验检测结果显示，特异识别人血清白蛋白的单克隆抗体与 rHSA/GCSF 有特异的免疫学反应，也与作为阳性对照品的血源人血清白蛋白（pHSA）和酵母菌表达的重组 HSA（rHSA）有免疫反应，但不与阴性对照品人粒细胞刺激因子（rhGCSF）有免疫反应；特异识别人粒细胞刺激因子的单克隆抗体则与 rHSA/GCSF 和阳性对照品重组人粒细胞刺激因子（rhGCSF）有免疫特异反应，但不与阴性对照品 pHSA 和 rHSA 有特异反应（图4）。免疫斑点法可以获得相同的鉴别结果。

图4 rHSA/GCSF 的免疫印迹鉴别试验（A：人粒细胞刺激因子单克隆抗体；B：人血清白蛋白单克隆抗体）Figure 4 The western-blotting results are from different first antibodies, mouse-monoclonal antibody against human granulocyte-colony stimulating factor (A) or mousemonoclonal antibody against human serum albumin (B)

2.5 rHSA/GCSF 的体外细胞学生物活性测定

rHSA/GCSF 原液的体外细胞学生物活性测定结果表明，融合蛋白 rHSA/GCSF 的生物比活性不低于 1.5×107IU/mg，而 rhGCSF 的生物比活性不低于 6.0×107IU/mg[22]。rHSA/GSCF 和 rhGCSF的分子质量比为85.2 kD∶18.67 kD = 4.6∶1。由此计算，在等摩尔时（4.6 mg 融合蛋白中有 1 mg 是GCSF），两者的生物活性没有差异（即 4.6 mg 的rHSA/GCSF 具有 6.9×107IU 的生物活性）。

2.6 rHSA/GCSF 蛋白质的物理特性分析

2.6.1 rHSA/GCSF蛋白质纯度分析 取 10 µg的 rHSA/GCSF 蛋白质在非还原条件下做 SDSPAGE，扫描后经分析软件计算，结果显示分离纯化的 rHSA/GCSF 电泳纯度达 99%（图3，泳道5）；反相-高效液相（RP-HPLC）在波长 280 nm 和214 nm 记录结果显示均为单一峰，峰面积不低于总面积的 98%（图5）。rHSA/GCSF 经凝胶分子排阻-高效液相（SEC-HPLC）测定获得相同的结果。因此，在原液中可能存在的单体 GCSF 分子、单体 HSA 分子和聚合体形式的 rHSA/GCSF，总共不会高于 20 µg/mg。

图5 融合蛋白 rHSA/GCSF 原液的反相-高效液相色谱法分析图谱（检测波长分别为214 nm 和 280 nm，蓝色为280 nm测定的峰图，纯度为99.384%；咖啡色为214 nm 测定的峰图，纯度为99.364%）Figure 5 The purity of rHSA/GCSF was analyzed by RP-HPLC at UV wave length 214 or 280 nm.(The blue color shows the purity is about 99.384%at 280 nm; the coffee color shows the protein purity is around 99.364%at 214 nm)

2.6.2 分子量测定 rHSA/GCSF 的分子量测定采用 SDS-PAGE 方法，在还原条件下以已知蛋白质分子量为参照物进行的直线回归方程计算，分子量测定结果为（85±8.6）kD。对 rHSA/GCSF 理化对照品用基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪进行测定为1 个峰，分子量为85 305 D，与理论分子量 85 215 D 值相近。

2.6.3 紫外圆二色光谱分析 应用紫外圆二色光谱仪分别对 rHSA/GCSF、rGCSF 和 rHSA 蛋白质溶液开展了远紫外光谱分析测定，对所获得的光谱曲线分别进行了叠加分析比较。在图6 中显示了rHSA + rGCSF、rHSA/GCSF、rHSA 和 rhGCSF 分子间圆二色光谱叠加。结果显示重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白和重组人血清白蛋白、重组人粒细胞刺激因子理论加和后叠加的圆二色图形相似度非常高，表明在融合蛋白中的人血清白蛋白和人粒细胞刺激因子的各自空间结构、蛋白质的二级和三级结构没有发生改变。本课题组也开展了重组 HSA（rHSA）和血源 HSA（pHSA）的紫外圆二色图谱叠加分析没有明显可见差异，因此可以肯定，用 pHSA 和 rGCSF 与 rHSA/GCSF 的圆二色图谱分析获得的结果与使用 rHSA 获得的结果应是一致的。

图6 对 rHSA/GCSF 蛋白质紫外圆二色叠加图谱分析Figure 6 Protein UV-Circular dichroism spectra (CD)analysis of rHSA/GCSF

2.6.4 甲醇和甘油残留量测定 无论采用变色酸比色法还是气相色谱法，在 rHSA/GCSF 原液中甲醇残留量都在 0.0001%（g/g）以下，远低于《中国药典》2005 版二部对原料药中残留溶剂-甲醇的限度要求值（0.3%）。采用气相色谱法测定甘油在原液中的残留量，结果显示残留量低于仪器和方法检出下限值，可以判定为未检出。

2.6.5 宿主蛋白质和外源性 DNA 残留量 采用商品试剂盒检测了 rHSA/GCSF 原液中的毕赤酵母菌宿主蛋白的残留量，结果表明原液中的宿主菌蛋白质含量在 0.05%以下，测定的回收率值在70%～130%之间，符合国家对注射用重组蛋白质药物中宿主蛋白质残留量限定的要求。rHSA/GCSF原液中的毕赤酵母菌外源性 DNA 残留量经测定，每毫克融合蛋白或以临床上剂量计算均小于10 ng/人。

2.7 rHSA/GCSF 的化学特性

2.7.1 N 端氨基酸序列测定 rHSA/GCSF 的 N端氨基酸序列测定的结果为：Asp-Ala-His-Lys-Ser-Glu-Val-Ala-His-Arg-Phe-Lys-Asp-Leu-Gly-，（D-AH-K-S-E-V-A-H-R-F-K-D-L-G-），与 rHSA/GCSF 氨基酸理论序列前 15 个氨基酸的序列相符。对不同批次制备的 rHSA/GCSF 原液，经不同检测单位（中国药品生物制品检定所和北京大学生命科学学院）进行的 N 端氨基酸序列测定都获得相同的结果。

2.7.2 等电点测定 rHSA/GCSF 的等电点测定结果为pI = 5.8 与理论值（pI 5.79）相近。

2.7.3 糖基化分析 利用高碘酸希夫碱（PAS）试剂法对糖蛋白进行检测。对 5 µg 的 rHSA/GCSF经过 SDS-PAGE 分离后使用试剂盒进行染色，随后经考马斯亮蓝 R250 复染的电泳胶（图7）进行比较，显示 rHSA/GCSF为非糖基化或低糖基化蛋白。

图7 rHSA/GCSF 蛋白质的糖基化染色测定和考马斯亮蓝复染色 SDS-PAGE 电泳分析Figure 7 Glycoprotein staining and coomassie brilliant blue re-staining of rHSA/GCSF SDS-PAGE

2.7.4 紫外光谱测定 rHSA/GCSF 原液呈典型蛋白质紫外吸收峰，最大吸收峰波长位于 277 nm左右。

2.7.5 自由巯基测定 rHSA/GCSF 样品烷基化封闭和不封闭条件下测试的质谱分子量分别为85512.2 D 和 85652.1 D，两者之差为139.9 D，计算 139.9/57 = 2.4，表明rhSA/GCSF 中含有 2.4 个自由巯基。理论氨基酸序列中，rHSA/GCSF 含有2 个自由巯基（半胱氨酸 C）分别位于第34 位和第602 位，因此测定值与理论值基本一致。

2.7.6 肽图分析 rHSA/GCSF 经变性和烷基化后，胰蛋白酶水解获得 RP-HPLC 肽图（图8）。肽图的结果批次间重现率很好，可以作为rHSA/CSF 原液的质量鉴别指标之一。根据已知 rHSA/CSF 的全长氨基酸序列计算出理论肽谱，将实测肽质量指纹图谱与理论图谱进行比对，检出氨基酸序列的覆盖率为84%（图1 中阴影部分）。rHSA/CSF 的 N 端氨基酸序列完全匹配到 257 个氨基酸残基；C 端匹配到 27 个残基。HSA 的 C 端和GCSF 蛋白质分子的 N 端，直接相连的氨基酸序列部位也清楚检出。rHSA/GCSF 的肽序列中氨基酸第627 至第731 之间的肽序列未能得到匹配，可能是因为这个肽段的氨基酸序列中既没有精氨酸 Arg（R）也没有赖氨酸 Lys（K），而精氨酸和赖氨酸是胰蛋白酶的酶切识别位点，由此形成一个长达 104 个氨基酸组成的长肽链。当待测蛋白质样品形成一个较长的多肽链时，会受到其他肽链的电荷干扰，就不能获得较好的匹配。

3 讨论

我们构建的表达 rHSA/GCSF 的重组毕赤酵母工程菌菌种传代稳定。所建立的发酵工艺经近百罐次不同规模的发酵验证，显示生产工艺稳定、具可重复性和线性放大能力，无机盐发酵培养基的配方组分简单，适合于大规模工业化生产重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白的要求。毕赤酵母工程菌表达的融合蛋白与抗人血清白蛋白或人粒细胞刺激因子的单克隆抗体分别有免疫学特异反应。通过体外细胞生物学活性测定，融合蛋白展示出人粒细胞刺激因子特有的生物学活性功能，并没有因与大分子 HSA 蛋白质形成融合蛋白后，产生体外生物活性显著下降的现象。这个结果与我们对人血清白蛋白与其他治疗性蛋白质药物所开展的研究结果有着极为显著的不同。例如人血清白蛋白与干扰素 α 形成的融合蛋白，其体外抗病毒的生物学活性丢失 2 个数量级以上，有着极为显著的体外生物学活性的下降[18]。rHSA/GCSF 的生物活性没有丧失是由于处于融合蛋白中的 GCSF 分子与测活用细胞表面 GCSF 的特异受体相结合的氨基酸空间结构区域，处于融合蛋白的表面，没有受到 HSA 大分子空间构型的干扰和影响所决定的。rHSA/GCSF 的蛋白质纯化工艺经多批次验证，工艺稳定可靠，并可线性放大。经发酵和纯化工艺获得的 rHSA/GCSF 原液符合临床用药对原料药纯度的要求，可以作为《注射用重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白》的原料药（原液）。

图8 在还原/烷基化条件下获得的不同批次制备的 rHSA/GCSF 融合蛋白的 RP-HPLC 肽图（A：批号为9314Y20080802；B：批号为9314Y20090305）Figure 8 The enzymatic peptide maps from different lots of rHSA/GCSF preparation under RP-HPLC chromatography (A：9314Y20080802；B：9314Y20090305)

对 rHSA/GCSF 开展的自由巯基分析结果肯定了在 rHSA/GCSF 蛋白质上有两个自由巯基，这与理论值相符。研究结果表明，在正确构象下的HSA 或 rHSA/GCSF 的第34 位半胱氨酸含有的自由巯基（C）不会与正确构象的另一个 HSA 分子或另一个 rHSA/GCSF 分子之间的这个自由巯基形成共价二硫键，这是因为第34 位的半胱氨酸被包裹在 HSA 分子内部，两个 HSA 分子之间不会形成以共价二硫键形式结合的二聚体，仅可形成电荷相吸形式的聚合体。rHSA/GCSF 的第602 位的半胱氨酸含有的自由巯基则可与另一个 GCSF（C17）或另一个 rHSA/GCSF（C602）蛋白质分子上的自由巯基形成共价二硫键（形成共价形式的二聚体后不能被轻易打开成为两个单体形式的蛋白质分子），形成聚合体形式后 GCSF 的生物活性将大大下降。当两个 rHSA/GCSF 之间通过这个 C形成共价二硫键形式的聚合体，或者一个 rHSA/GCSF 和一个 GCSF 之间形成聚合体时，这个聚合体是不可再转化成单体蛋白质分子的（当两个GCSF 之间由自由巯基形成共价二硫键聚合体时，可以通过变性-再复性，来获得两个单体活性 GCSF分子，而融合蛋白是不能通过复性-再复性的方法成为单体融合蛋白的）。在 rHSA/GCSF 的生产和制备过程中需要特别注意减少聚合体形成的机会。提高单体 rHSA/GCSF 的得率和在注射剂的成品中维持单体状态的 rHSA/GCSF 是生产和质量评价的决定性关键技术指标。

rHSA/GCSF 的理化特性分析表明，经分离纯化的融合蛋白在物理特性分析中显示，在 SDSPAGE 电泳、RP-HPLC 和 SEC-HPLC 测定中均呈单一峰；对原液中的甲醇、甘油、毕赤酵母菌宿主蛋白质和外源性 DNA 的残留量进行测定方法的建立，方法学验证，检定结果表明 rHSA/GCSF 原液的蛋白质纯度分析结果可靠、各种外源物质的残留量均符合治疗用生物制品对外源物质残留量的要求。对 rHSA/GCSF 的化学特性分析结果表明融合蛋白的紫外吸收特性测定，显示具有蛋白质特定的紫外吸收峰值；融合蛋白的等电点和分子量鉴定结果也符合理论计算值；N 端蛋白质序列测定证明了由毕赤酵母菌分泌出的 rHSA/GCSF 融合蛋白的切割加工过程正确，获得的融合蛋白是单一肽链序列，结合所进行的肽质量指纹图谱测定，融合蛋白的 N 端、C 端可以完整匹配，也证明由毕赤酵母菌表达，独创的分离纯化工艺制备的融合蛋白的蛋白质分子是完整的。圆二色光谱分析证明rHSA/GCSF融合蛋白的 HSA 和 GCSF 分子各自的空间结构没有因为形成融合蛋白而发生分子错配现象，维持了各自的二硫键正确配对；所建立的融合蛋白纯度测定方法简单可行。利用 RP-HPLC进行融合蛋白的肽图分析方法简单，重现性高而且图形稳定，可以作为与理化对照品或批次间原液生产制备的鉴别手段之一。

对比文献[15-16]使用酿酒酵母表达的 rHSA/IFNα2b 和 rHSA/GCSF 融合蛋白，我们使用毕赤酵母来表达 rHSA/GCSF要有较明显的优势，首先是表达量要高 10～100 倍，其次融合蛋白被酵母糖基化水平也要低得多。可以确定通过毕赤酵母工程菌表达，经分离纯化获得的 rHSA/GCSF 纯品，符合作为原料药的要求，rHSA/GCSF 的分子结构清楚，制备工艺稳定、可重复和具有线性放大的能力，药物质量标准明确、全面，检定方法稳定可靠。通过对 rHSA/GCSF 蛋白质理化特性所开展的独立研究，我们获得了十分有益的数据和实验结果，可以指导原料药的生产和质量标准指标的建立。本课题组将继续报道利用所制备的原料药进行注射用重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白新药研发的制剂配方筛选研究和已完成的药效学、药动/药代、毒代、急毒、长毒相关的药理毒理安全性评价的研究结果。

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