雌激素对人脐带来源间充质细胞骨架和超微结构的影响

赵叶琳，赵晓寅，孙凌云，侯亚义

人脐带间充质干细胞（MSC）具有免疫抑制作用和多向分化潜能，被用于治疗各种疾病。而雌激素与许多自身免疫性疾病的发生与发展有关，以前的研究中发现 17β-雌二醇（E2）能影响破骨细胞内细胞骨架的结构，下调微丝肌动蛋白（F-actin）的表达，降低破骨细胞的活动能力，从而抑制破骨细胞的骨吸收功能[1-2]。E2对 MSC 有多种调节作用，如能抑制 MSC 的成骨分化[3]及抑制 MSC 的免疫调节功能[4]。但关于 E2 对 MSC 细胞骨架和超微结构的影响还未见报道。

F-actin 呈纤维状，是构成细胞内微丝骨架的主要部分。肌动蛋白相关蛋白2/3（Arp2/3）复合物又是构成 F-actin 的结构基础[2]。F-actin 在细胞内的聚合及解聚，与细胞的运动、形态及细胞内外的信息传递等功能有关，为细胞内外信息传递提供分子桥梁，控制细胞形态、运动和增殖等生物效应[5-6]。

纽蛋白（vinculin）是一种与黏着类型连接形成有关的细胞骨架蛋白，存在于细胞—细胞及细胞—基质间的黏着部位，其作用是将 F-actin 锚着于连接点形成部位的细胞膜上[7]。纽蛋白的表达对 MSC的黏附功能有着重要作用[8]。

本研究中，我们通过激光共聚焦显微镜（laser confocal microscope，LCM）观察了 E2 作用下细胞骨架和细胞连接的情况，用透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）观察细胞内部细胞器的变化，探讨 E2 作用后 MSC 功能变化的可能原因。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 自然足月剖腹产的健康胎儿脐带，获自南京大学医学院附属鼓楼医院。所用材料均严格遵守医学伦理道德，经产妇及家属认可，并经医院医学伦理委员会批准。

1.1.2 主要试剂 DMEM/F12 培养基和优级胎牛血清（FBS）购自美国 Gibco 公司；胶原酶 II、中性蛋白酶、透明质酸酶购自美国 Sigma 公司；荧光标记小鼠抗人抗体 PE-CD117、PE-CD44、PE-CD29、FITC-CD31、FITC-CD45 和 APC-CD105单克隆抗体购自美国 Ebioscience公司；鼠 IgG-PE、鼠抗人纽蛋白单克隆抗体购自美国 Santan 公司；17β-雌二醇、鬼笔环肽（Phalloidin- FITC）购自美国 Sigma 公司；明胶、牛血清白蛋白（BSA）购自中国 sunshine 公司；聚乙二醇辛基苯基醚（Triton 100）购自中国 beyotime 公司。

1.1.3 仪器 FACSCalibur 流式细胞仪为美国BD 公司产品；FV10i 型激光共聚焦显微镜为日本Olympus 公司产品；Philipscm12 型透射电子显微镜为荷兰 Philips 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 人脐带来源间充质细胞的分离及纯化 取足月剖腹产胎儿的脐带，在无菌状态下用预冷的含 0.01%青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，去掉脐带内血块。在 DMEM/F12 基本培养基中，将脐动脉剥除，其余部分剪成 2mm3碎块，250 U/ml 的胶原酶 II、100 U/ml 中性蛋白酶和 10 U/ml 透明质酸酶以 1∶1∶1 的比例加入组织中，37℃振荡消化 3 h 至组织基本消化完全。离心去上清，用基本培养基洗 3 次，再培养于含 10%FBS 的 DMEM/F12 完全培养基中。调整细胞密度为1×109个/L，于 37℃，5%CO2培养箱中培养。3～4 d 后，轻轻晃动培养板，全量换液，待细胞铺满度达 80%左右，用 2.5 g/L 的胰酶消化，常规传代。取第3 代细胞，分析其表面标志，确定其为MSC 后用于试验。

1.2.2 流式细胞仪测定细胞表面标志 消化、收集细胞，PBS 洗涤 2 次，调整细胞密度约 1×106个/ml。共 3 例脐带 MSC，每个标记设 3 复孔，加入同型对照和相应抗体，4℃避光孵育 30min，PBS 洗涤 2 次后上机检测。MSC 检测标志为：CD117、CD29、CD31、CD44、CD105 及 CD45。

1.2.3 细胞爬片及免疫荧光标记 将盖玻片用75%酒精浸泡 30 s，换到 95%酒精浸泡 30 s，烧干盖玻片。将盖玻片放到 12 孔培养板里，加覆500 μl 左右 1%的无菌明胶，37℃孵育 2 h，吸去明胶，PBS 洗，5×105个/ml 细胞悬浮于完全培养基中，每孔加入 1 ml 细胞悬液，分别加入10-7nmol/L 和 10-8nmol/L 的 E2 处理 12、24 和48 h。对照组相同体系培养，以同体积的 PBS 代替 E2。将细胞爬片用 4%多聚甲醛固定 30min，PBS洗 3 次，0.1%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton 100）室温处理 15min，PBS 洗 3 次，用 3%牛血清白蛋白（BSA）室温封闭 1 h，PBS 洗，加一抗鼠抗人纽蛋白单抗，4℃过夜。PBS洗 3 次，分别加抗鼠 IgG-PE 和 Phalloidin-FITC，室温孵育1 h，PBS洗 3 次，最后 DAPI 染核 10min，PBS洗 3 次，加防荧光猝灭剂封片。

1.2.4 透射电镜样品制备 将 E2 处理过的脐带MSC 200×g离心 5min，用预冷的 PBS 洗涤2 次，2.5%戊二醛（0.01 mol/L 二甲胂酸钠配制）固定 4℃过夜。0.01 mol/L 二甲胂酸钠缓冲液洗涤，l%锇酸 4℃固定 l h。梯度丙酮脱水，环氧树脂 Epon812 包埋，常规超薄切片，醋酸双氧铀及枸橼酸铅双染色后置透射电镜下观察。

2 结果

2.1 MSC 的形态学观察和表面标记物检测

原代培养早期细胞形态异质性较大，以梭形、多角形为主。消化传代后，从第3 代起开始稳定生长，可获得较均一的 MSC。细胞形态为梭形或成纤维样，体积较大，单核，呈漩涡样生长（图1）。流式细胞仪检测显示，脐带 MSC 稳定均一地表达CD29 和 CD44（纤维蛋白和透明质酸盐的受体，由基质细胞表达）、CD105（SH-2）；不表达 CD117（多能造血干细胞标志）、CD31（内皮细胞标志）和 CD45（造血细胞标志）。经 3 代以上传代后，细胞成分均一，纯度在 95%以上（图2）。

图1 人脐带来源 MSC 的细胞形态（A：第2 代；B：第3 代）Figure 1 The morphology of human umbilical cord MSC (A:P2; B: P3)

2.2 LCM 观察细胞骨架

正常的脐带 MSC 细胞 F-actin Phalloidin-FITC 荧光染色为绿色，呈细丝状，主要沿细胞长轴分布，贯穿整个 MSC 细胞（图3A）。Vinculin 免疫染色为红色，呈点状，簇状着染于肌动蛋白两端，分布于胞浆中细胞膜侧（图3B，白色箭头）。胞浆与细胞核中见非特异性着染，细胞核染色为蓝色。10-7nmol/L E2处理 48 h 后，对肌动蛋白分布无太大影响（图3D），Vinculin 主要分布于胞浆中靠细胞核侧（图3E）。10-8nmol/L 组各时间点细胞形态及肌动蛋白分布均无明显变化。

2.3 TEM 观察细胞超微结构

图2 人脐带 MSC 的表面标志（阴影部分为同型对照）Figure 2 The surface marker of human umbilical cord MSC (Shadow area was isotype control)

图3 E2 作用后 MSC 细胞骨架的变化（F-actin 着染绿色荧光，白色箭头指向的红色亮点为vinculin） （A：对照组 F-actin--FITC 荧光染色；B：对照组 vinculin 荧光染色；C：对照组 F-actin 和 vinculin 染色叠加；D：E2 组 F-actin--FITC 荧光染色；E：E2 组 vinculin 荧光染色；F：E2 组 F-actin 和 vinculin 染色叠加）Figure 3 Changes of cytoskeleton of MSC after E2 treatment [ Cell cytoskeleton proteins F-actin (Green) and vinculin (Red, white arrows showed vinculin) ](A: Control FITC-F-actin; B: Control PE-vinculin; C: A and B overlap; D: E2 FITC-F-actin; E: E2 PE-vinculin; F: D and E overlap)

10-7nmol/L E2 处理 MSC 48 h 后，透射电镜观察细胞的超微结构。对照组细胞核呈圆或卵圆不规则形，双层核膜完整，核仁大而明显，常异染色质分布均匀，粗面内质网、滑面内质网、线粒体等细胞器数量丰富、结构清晰（图4A、B、C）。E2 处理后的 MSC 透射电镜下见有部分细胞开始出现结构异常现象，有的胞质内出现大量大小不等的空泡（图4D）和自噬体，自噬体内含有未被完全消化的残余细胞器和胞质成分，即髓鞘样小体（图4F）。

图4 E2 作用后 MSC 细胞超微结构的变化（箭头指向细胞空泡和自噬体） （A：对照组 10 000×；B：对照组 20 000×；C：对照组 40 000×；D：E2 组 10 000×；E：E2 组 20 000×；F：E2 组 40 000×）Figure 4 Changes of ultrastructure of MSC after treated with E2 (Arrows showed vacuoles and autophagosome) (A: Control 10 000×; B: Control 20 000×; C: Control 40 000×; D: Treat with E2 10 000×; E: Treat with E2 20 000×; F: Treat with E2 40 000×)

3 讨论

细胞骨架在细胞的增殖，维持细胞形态、极性、内吞作用，胞内物质运输，信号转导，细胞活性，运动能力等方面起着重要作用。细胞骨架包括微管、微丝和中间丝三部分，分别与细胞膜上的蛋白质和脂分子相互连接，成为细胞运动、细胞形态和跨膜信息传递的基础。F-actin 呈纤维状，构成细胞内微丝骨架的主要部分，而 Arp2/3 复合物是构成F-actin 的结构基础。微丝的肌动蛋白有两种存在方式：一种是聚合态（F-actin），另一种是游离状态（G-actin）。当细胞功能活跃时，F-actin 伸长通过其膜上黏着相关分子（肌动蛋白结合蛋白）介导，将肌动蛋白连接于细胞外基质，将轴突向此方向拉动。当不能与细胞外基质形成黏着类型的连接时，F-actin 解聚。这种解聚和聚合的变化与细胞的附着、运动、形态及细胞内外的信息传递等功能有关，为细胞内外信息传递提供分子桥梁，控制细胞形态、运动、增殖等生物效应[9]。微丝肌动蛋白的聚合和解聚随着生理和病理条件发生改变，在本实验中，用共聚焦显微镜未观察到 F-actin 在分布和表达水平的变化。

Vinculin 是一种与黏着类型连接形成有关的细胞骨架蛋白，其作用是将 F-actin 锚着于连接点形成部位的细胞膜上。已有报道，在培养细胞的胞浆内有一纽蛋白池，其与膜联的纽蛋白间形成动力学平衡[3-4]。通过这种平衡，来控制细胞的形态和运动能力。目前关于点状连接部位纽蛋白分布及作用的报道很多，但关于胞浆内纽蛋白池在细胞超微结构的分布，至今未见报道。本实验结果表明，正常情况下纽蛋白在靠近细胞膜侧分布，认为是细胞与培养基质间形成黏着连接的部位，而胞浆内的纽蛋白呈均匀的网格状分布，可能与微丝的分布相关。而经 E2 处理后，纽蛋白主要分布于胞浆中靠细胞核侧。这种变化可能导致胞浆内纽蛋白池与膜联的纽蛋白间动力学失衡。从而影响 MSC 的运动和趋化至病理部位的能力。

细胞的超微结构显示了细胞中细胞器的形态、数量的变化，从而揭示了细胞的分裂、衰老和凋亡情况。透射电镜的结果表明，正常 MSC 超微结构良好，细胞器较丰富，有完成最基本细胞功能的细胞器，如线粒体、核糖体、粗面内质网等。E2 处理后，MSC 超微结构则明显出现了衰老和凋亡特征：细胞内出现了大量空泡（可能来源于线粒体肿胀变性），周围出现双层膜空泡结构，继而双层膜环绕成自噬体，进而与溶酶体融合、消化，形成自噬体不能消化的残体。这些变化表明细胞的蛋白合成和有氧呼吸功能受到影响，大量细胞内具有较多的自噬体和消化未尽的髓鞘样小体，表明这些细胞可能出现衰老现象，而其自身已经开始了自我保护性反应。粗面内质网和线粒体数量反而增加，可能是细胞为了维持平衡出现的代偿性增加。朴英杰等[10]首次提出了细胞自噬性凋亡的概念，阐明其为一种细胞自我保护反应。当细胞进入衰老阶段或功能异常时，也可通过细胞凋亡来结束自身的生命。我们观察到的细胞中也有自噬性凋亡现象的发生。总之，E2 存在的情况下，MSC 的超微结构和细胞骨架发生异常，这种异常可能与 E2 作用下 MSC的增殖、凋亡、贴壁以及迁移能力的变化有关。

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