淋病奈瑟菌opa基因分型方法的流行病学应用

陈强，王思思，尹跃平，卢红艳

淋球菌 opa 基因分型方法由 O’Rourke 等[1]于 1995年首先创建，他还对该分型方法的分辨力、重复性及其稳定性给予了肯定评价。此后国外陆续有使用 opa 基因分型方法对淋病奈瑟菌进行基因分型的性网络研究报告，如 Fjeldsøe-Nielsen等[2]在丹麦、Howie 等[3]在英国爱丁堡、Khaki 等[4]在印度新德里对该分型方法均作了研究报告，并对其在流行病学上的应用给出了一致的好评。但国外有关此方面的研究都在一个区域或城市展开，且样本量普遍不大，无论在数量还是范围上都难以充分体现该分型方法在流行病学应用上的优势，国内也尚未见大样本 opa 分型的报告。本研究拟在我国东部和南部的 4 个城市（南京、济南、福州、南宁）收集淋球菌株行 opa 基因分型，分别并综合分析四地 opa 基因分型结果，初步探讨我国东部及南部地区 4 个城市中 opa 基因型的大致分布状况，分析不同地区之间基因分型的关联性，为我国性网络的研究提供一种新的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 淋病患者来自 4 个城市，即南京（中国医学科学院皮肤病研究所，2006年4月–10月）、济南（山东省皮肤病防治所，2006年5月– 2007年2月）、福州（福建省皮肤病防治所，2006年3月– 9月）及南宁（广西壮族自治区皮肤病防治所，2006年3月– 2007年2月）。男性标本采自尿道分泌物，女性标本采自宫颈分泌物，标本采集方法根据现行的标准方法进行。采集后的淋球菌在 36℃条件下培养 24～36 h 后经转种并分纯。所有菌株经氧化酶及糖发酵试验确证为淋病奈瑟菌。经确证的菌株洗脱于脱脂牛奶管并置–70℃冰箱中保存。

1.1.2 主要试剂与仪器设备 CT/NG 核酸提取试剂盒购自美国 Roche 公司；Taq DNA 聚合酶、TaqI限制性内切酶、HpaII限制性内切酶均购自美国 Promega 公司；GeneAmp PCR 9600 扩增仪购自美国 Perkin Elmer 公司；水平电泳仪及电泳槽购自北京六一仪器厂；垂直电泳仪及电泳槽、凝胶成像仪均购自美国 Bio-Rad 公司；GelCompar II 凝胶分析软件来自比利时 Applied Maths 公司。

1.2 方法

1.2.1 淋球菌基因组 DNA 模板制备 按 Roche CT/NG 核酸提取试剂盒说明书进行操作，具体操作过程如下：①将 1/3 环淋球菌混悬到 400 μl 双蒸水中；②在 1.5 ml Eppendorf 管中加入 100 μl裂解液；③取 100 μl 混悬的淋菌标本至 100 μl 裂解液中，混悬 30 s；④室温孵育 10min；⑤每管加入 200 μl 稀释液，混悬 10 s；⑥室温孵育10min；⑦取 50 μl 进行 PCR；⑧多余的储存于2～8℃，用时混悬，12500×g 离心 10min。

1.2.2 Opa 基因扩增 扩增引物参照文献设计[5]，上游引物为5’ ATGTGCAGGCGGATTTAGCC 3’；下游引物为5’ AATGAGGCTTCGTGGGTTTTG 3’，引物由上海生工生物工程有限公司合成。扩增片段长度为550 bp。PCR 反应体系如下：10×Taq DNA polymerase buffer 10 μl，Taq DNA polymerase 2 U，dNTPs（10mmol/L/each）8 μl；上下游引物各5 μl（50 pmol/L），模板 DNA 20 μl，25mmol/L MgCl26 μl，反应体系加灭菌蒸馏水至 100 μl。反应条件：预变性 94℃2min，然后（94℃20 s，65℃20 s，72℃40 s）×35 循环，最后末次延伸 72℃10min。PCR 产物检测用 1×TBE 制备 1.5%琼脂糖凝胶，其中含有 1.0 μg/ml EB；将水平电泳仪电压调整为100 V，电泳时间为40min。

1.2.3 限制性酶切 每一份 PCR 扩增产物都分别进行 TaqI和 HpaII限制性酶切，内切酶酶切体系均为20 μl， TaqI酶切体系与 HpaII酶切体系均 65℃过夜孵育。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳 具体操作方法如下：①制备 10%聚丙烯酰胺凝胶，使之在室温中聚合 40min，至梳齿下出现 Schlieren 线；②取5 μl 样品，加入 1 μl 6×DNA 上样缓冲液，混匀后上样；③电泳槽 150 V 预热 10min 后开始电泳，电泳条件为150 V×60min，电泳液为1×TBE；④染色：电泳完毕后将凝胶从电泳槽中取出放于 10%乙醇液中固定 5min，蒸馏水洗数秒，1%硝酸溶液浸胶 5min，蒸馏水洗数秒，染色液中染色 10min，蒸馏水冲洗两次凝胶，置于显色液中显色至适当颜色，再用 10%冰乙酸终止反应并固定凝胶 5min。

1.2.5 图像处理与聚类分析 将固定后的聚丙烯酰胺凝胶用蒸馏水冲洗后置于凝胶成像系统中采用白光模式拍照，照片以 TIFF 格式输入到GelComparII 凝胶分析软件中，按照操作说明书进行相应的聚类分析。

1.2.6 TaqI 酶切结果的定义方法 淋球菌 opa基因被限制性内切酶 TaqI 酶切后所产生的各种不同酶切图谱的类别被定义为TaqI 型，大部分 TaqI型仅由一株淋球菌组成，部分 TaqI 型通过聚类分析法后观察到包括两株或两株以上的淋球菌；包含两株或两株以上淋球菌的 TaqI 型又称为TaqI簇。

1.2.7 HpaII 酶切结果的定义方法 为了进一步细化分型，TaqI 簇可以被 HpaII酶进一步分类：①相似性 TaqI 簇定义为一个 TaqI 簇中各 opa基因被限制性内切酶 HpaII 消化后它们的酶切条带图谱仅有一处条带的差异；②差异性 TaqI 簇定义为一个 TaqI 簇中各 opa 基因被限制性内切酶HpaII 消化后它们的酶切条带图谱存在明显的差异，即存在两处条带或以上的差异；③等同性 TaqI簇定义为一个 TaqI 簇中各 opa 基因被限制性内切酶 HpaII 消化后它们的酶切条带图谱仍保持100%的同一性；④opa 型定义为淋球菌的 opa 基因先后被限制性内切酶 TaqI 和 HpaII 消化后具有唯一性的酶切条带图谱；⑤opa 簇定义为一组淋球菌的 opa 基因先后被限制性内切酶 TaqI 和HpaII 消化后它们的酶切条带图谱分别能达到100%的同一性。

2 结果

2.1 菌株收集情况与 PCR 扩增结果

4 个城市中，共有 468 名患者被确诊为淋病，其中南京 117 例、济南 103 例、福州 147 例、南宁 101 例。在这 468 例淋病患者中，其中有 36例患者未获得阳性培养结果，102 例在 –70℃保藏后未能复苏。4 个城市中实际做分型的菌株分别为：南京 86 例、济南 80 例、福州 94 例、南宁70 例，共计 330 例。其中来自南京的菌株用 NJ表示；来自济南的菌株用 JN 表示；来自福州的菌株用 FZ 表示；来自南宁的菌株用 NN 表示。

2.2 TaqI 酶切及其聚类分析

南京 86株淋球菌 opa 基因经 TaqI 酶切后的聚类分析产生 77 个 TaqI 型，其中 68个 TaqI型各由一株菌组成，9 个 TaqI 型各由 2株菌组成。济南 80株淋球菌 opa 基因经 TaqI 酶切后的聚类分析产生 68 个 TaqI 型，其中 58 个 TaqI型各由一株菌组成，10 个 TaqI 型由 2株或 2株以上的菌株组成。福州 94株淋球菌 opa 基因经TaqI 酶切后产生 83 个 TaqI 型，其中 74 个TaqI 型各由一株菌组成，9 个 TaqI 型由 2株或2株以上的菌株组成。南宁 70株淋球菌 opa 基因经 TaqI 酶切后的聚类分析产生 63 个TaqI 型，其中 58 个 TaqI 型各由一株菌组成，5 个 TaqI型由 2株或 2株以上的菌株组成。以上 4 个城市共 330株淋球菌的聚类分析显示：330株淋球菌共产生了 275 个互不相同的 TaqI 型，其中231 个 TaqI 型各由一株淋球菌组成，余下的99株淋球菌分属于 44 个 TaqI 型（簇），包括35 组对子，7 组各含有 3株淋球菌，2 组各含有4株淋球菌。

2.3 HpaII 酶切及其聚类分析

对以上分属于 44 个 TaqI 簇的 99株淋球菌opa 基因进行限制性内切酶 HpaII 消化。在这44 个 TaqI 簇中，其中 15 个 TaqI 簇每组所包括的淋球菌来自两个或以上的城市。这 15 个 TaqI簇所包括淋球菌的 opa 基因在进一步接受限制性内切酶 HpaII 消化后没有等同性 TaqI 簇出现，产生了 2 个相似性 TaqI 簇和 13 个差异性 TaqI簇。因此，在 15 个 TaqI 簇中，通过 TaqI 和HpaII 两种限制性内切酶的分别消化共产生了34 个 opa 型。在 44 个 TaqI 簇中有 29 个 TaqI簇每组所包括的淋球菌来自同一城市。这 29 个TaqI 簇所包括淋球菌的 opa 基因在进一步接受限制性内切酶 HpaII 消化后共产生 14 个等同性TaqI 簇，7 个相似性 TaqI 簇和 8 个差异性 TaqI簇。因此在 29 个 TaqI 簇中，通过 TaqI 和 HpaII两种限制性内切酶的分别消化共产生了 44 个opa 型（表1）。

表1 330株淋球菌 TaqI 和 HpaII 限制性酶切后的 opa 基因分型结果Table 1 Opa typing of 330 isolates of N.gonorrhoeas with TaqI and HpaII

2.4 TaqI 与 HpaII 酶切结果分析

对所有调查的 330株淋球菌先后采用限制性内切酶 TaqI 和 HpaII 进行 opa 基因分型后共产生了 309 个 opa 型，其中有 292 个 opa 型各包含一株淋球菌，14 个 opa 型各包含 2株淋球菌，2 个 opa 型各包含 3株淋球菌，还有一个 opa 型包含 4株淋球菌（表1）。在 292株各代表一个opa 型的淋球菌中，通过聚类分析所生成的树状图我们还发现有 18株淋球菌形成 9 个相似对子。在研究对象的四个城市中，包含一株菌的 opa 型占各城市所有 opa 型数量的比例分别为：南京90.7%，济南 77.5%，福州 89.4%，南宁 97.1%。

图1 分属于 44 个 TaqI 簇的 99株淋球菌 opa 基因 HpaⅡ 酶切图谱聚类分析Figure 1 Master dendrogram of relationships between 44 TaqI clusters of 99 isolates of Neisseria gonorrhoeae as calculated by the Dice coefficient

2.5 Opa 簇

TaqI 和 HpaII 两种限制性内切酶共确定26 个包括两株或以上菌株的组，其中包括 17 个opa 簇（菌株间 opa 基因的相似性为100%，14 个opa 簇各包含两株菌，2 个 opa 簇各包含三株菌及一个包含四株菌的 opa 簇）和 9 个 opa 型相似对（菌株间 opa 基因的相似性在 90%～100%之间）（图1）。而患者的流行病学资料显示在 19 名淋病患者中存在 9 组已知的性接触（包括 8 对及1 个三人组）。其中 8 个已知的性接触信息由8 个 opa 簇所确证，剩下的一个性接触信息也被一个 opa 型相似对所印证。

3 讨论

在淋病的流行病学调查研究中，opa 分型是一种分辨力很高的基因分型方法，这种方法也被认为是一种能指定患者之间存在性联系的可靠指针[1, 6-7]。

研究发现在使用第一种限制性内切酶 TaqI 后330株淋球菌共产生了 44 个 TaqI 簇，其中15 个 TaqI 簇各自包含的淋球菌来自两个或以上的城市，余下 29 个 TaqI 簇各自包含的淋球菌来自同一个城市。用第二种限制性内切酶 HpaII 对这44 个 TaqI 簇做进一步的酶切聚类分析，有趣的是我们发现在这 15 个不同城市菌株来源的 TaqI 簇中没有产生等同性 TaqI 簇，而 29 个相同城市菌株来源的 TaqI 簇产生了 14 个等同性 TaqI 簇，占 48%。同样，15 个不同城市菌株来源的 TaqI 簇仅产生了 2 个相似性 TaqI 簇，而 29 个相同城市菌株来源的 TaqI 簇产生了 7 个相似性 TaqI 簇。由此可见不同城市菌株来源的 TaqI 簇比相同城市菌株来源的 TaqI 簇更容易被第二种限制性内切酶HpaII 所分解，这表明相同城市来源的菌株在基因水平上比不同城市来源的菌株更具有相似性，这也在一定程度上表明各不同城市淋球菌 opa 基因具有它们各自的特征，相互之间保持相对的独立性。

从另一个层次上说，opa 基因分型方法用两种限制性内切酶共确定 26 个包括两株或以上菌株的组，其中包括 17 个 opa 簇和 9 个 opa 型相似对。这 26 个组中的绝大多数（17 个 opa 簇和7 个 opa 型相似对）其各组中所包含的淋球菌均来自同一个城市。我们未发现任何等同性 TaqI 簇包含的淋球菌来自两个或以上的城市，也仅有2 个相似性 TaqI 簇包含的淋球菌来自两个不同的城市。和我们的研究相比而言，英国 Palmer 等[8]所做的 opa 基因分型研究显示：属于某一共同 opa型的淋球菌可以分布在英格兰及南威尔士的各个城市中。而我们的研究结果表明在基因水平上来自同一城市的淋球菌比来自不同城市的淋球菌具有更大的相似性，而且每个城市都具有其独特的 opa型，各个城市在 opa 型的分布上具有相对的独立性。

研究中我们还发现患者所提供的性接触信息和我们的实验结果之间具有较高的一致性。Opa 分型确证了所有由患者提供的性接触信息，显示了opa 分型方法的分型能力及其在确证患者性联系方面的正确性。除此之外 opa 分型发现的 opa 簇要比患者性接触信息反映的性关系数量更多。这也说明 opa 基因分型方法在揭示患者性接触方面所能反映的信息比患者愿意提供的性接触信息更丰富。两者之间存在差异的原因在文献[9]中也有所报道，这包括 opa 基因随着时间的推进而发生自然演化以及可能存在的混合感染，混合感染意味着一位淋病患者同时携带两种不同 opa 型的淋球菌。但根据我们研究提供的菌株收集资料来看，所有存在性联系的菌株它们在标本采集时间上的间隔都是很短的，除了一对菌株收集的时间间隔为9 d，另一对大概在 1 个月左右外，其余大多数间隔时间都在 2 d 以内。O'Rourke 等在他们的研究中还发现用限制性内切酶 TaqI 给连续十次传代淋球菌的 opa 基因分别进行酶切消化，发现它们的酶切图谱还能保持一致，这说明在一定程度上 opa分型具有相对的稳定性。从 O'Rourke 等[1]的研究中可以推算，在较短的时间跨度之内我们研究中的opa 基因不可能发生明显的演化。而混合感染在我们研究的菌株间也不可能发生，因为除了一株淋球菌外其他所有分离株携带者在此前一年时间内都没有过诊断淋病的记录。导致这种差异更为真实的原因可能是患者提供的性接触信息不完整，也就是说一些淋病患者不愿透漏自己与其他淋病患者之间存在某种程度上的性联系，这就是为什么一些实验室结果反映的信息量要比患者提供信息量大的原因。另一种可能解释就是实验室确立的性联系淋球菌菌株来自于一个有性联系的集团，集团中各菌株分属于相同或相似的 opa 型，菌株携带者之间可能没有直接的性接触，但他们却共处于一条性传播链上。

总而言之，本研究对 330株淋病奈瑟菌进行opa 分型使我们获得了比患者提供的性接触资料更为丰富的信息。然而在整个研究当中我们并没有发现较大规模的 opa 簇。Opa 分型方法能提供给研究者一些性接触信息，这些信息淋病患者自身并不愿提供给他人。正是 opa 基因分型方法所具有的这种能力帮助我们更好地了解淋球菌的传播路径、为淋球菌传播的控制提供预防、控制和追踪措施。

[1]O'Rourke M, Ison CA, Renton AM, et al.Opa-typing: a high-resolution tool for studying the epidemiology of gonorrhoea.Mol Microbiol, 1995, 17(5):865-875.

[2]Fjeldsøe-Nielsen H, Unemo M, Fredlund H, et al.Phenotypic and genotypic characterization of prolyliminopeptidase-negative Neisseria gonorrhoeae in Denmark.Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2005,24(4):280-283.

[3]Howie F, Young H, McMillan A.The diversity of the opa gene in gonococcal isolates from men who have sex with men.Sex Transm Infect, 2004, 80(4):286-288.

[4]Khaki P, Bhalla P, Fayaz AM, et al.Molecular typing of neisseria gonorrhoeae isolates by opa-typing and ribotyping in New Delhi,India.Int J Microbiol, 2009, 2009:934823.

[5]Viscidi RP, Demma JC, Gu J, et al.Comparison of sequencing of the por gene and typing of the opa gene for discrimination of Neisseria gonorrhoeae strains from sexual contacts.J Clin Microbiol, 2000,38(12):4430-4438.

[6]Bilek N, Martin IM, Bell G, et al.Concordance between Neisseria gonorrhoeae genotypes recovered from known sexual contacts.J Clin Microbiol, 2007, 45(11):3564-3567.

[7]Morris AK, Palmer HM, Young H.Opa-typing can identify epidemiologically distinct subgroups within Neisseria gonorrhoeae multi-antigen sequence type (NG-MAST) clusters.Epidemiol Infect,2008, 136(3):417-420.

[8]Palmer HM, Leeming JP, Turner A.Investigation of an outbreak of ciprofloxacin-resistant Neisseria gonorrhoeae using a simplified opa-typing method.Epidemiol Infect, 2001, 126(2):219-224.

[9]Ward H, Ison CA, Day SE, et al.A prospective social and molecular investigation of gonococcal transmission.Lancet, 2000, 356(9244):1812-1817.