溃疡性结肠炎患者正常与病变肠段肠道菌群比较

刘 伟，刘 翔，林漫鹏，郑雪玲，杨 涛

广州医学院第二附属医院消化内科(广东 广州 510260)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种慢性非特异性的炎症性肠病，其病因和发病机制尚不明确。目前多认为是由多种因素共同作用的结果，主要包括感染、免疫、遗传、精神及心理等因素，其中感染因素在UC发病中发挥重要作用，因此近年来对UC和肠道菌群之间的关系展开了大量的研究。肠道菌群失调对于UC的致病机制究竟有何意义尚不完全清楚，故本项目选取病变仅局限于乙状结肠以下的溃疡性结肠炎患者，分别在乙状结肠以上的正常肠段和乙状结肠以下的病变肠段用结肠镜取得活检标本，用PCR方法检测标本的细菌含量，从而比较正常肠段和异常肠段的菌群差异，以探讨肠道菌群失调在UC致病机制中的可能作用。

1 资料和方法

1.1患者入选标准溃疡性结肠炎患者40例，均为我院就诊的患者，均经结肠镜和病理学检查确诊，且病变均局限在乙状结肠及以下肠段。其中男性患者21例，女性患者19例，年龄16～83岁，平均年龄52岁，分别在病变肠段(乙状结肠以下肠道)及正常肠段(乙状结肠以上肠道)取粘膜组织做细菌学检查。另选40例正常对照，其中女性20例，男性20例，年龄18～75岁，平均年龄48岁，分别在乙状结肠以上肠段及乙状结肠以下肠段取粘膜组织做细菌学检查。

1.2材料和仪器DNA提取试剂购自广州达安基因，10×PCR buffer、dNTPs、Taq酶等购自Tiangen公司。常规的化学试剂为分析纯。生物安全柜Bioaer公司BSC-1500Ⅱ型，荧光PCR仪Biorad公司MJ Opticon2型。

细菌引物：上游通用引物BEL863f：CAGGATTAGATACCCTGGTAGTCC；下游特异引物：双歧杆菌引物B953r：CGTTAGCTCCGACACGGAACCC；乳酸杆菌引物L961r：GCTTAATGCGTTAGCTGCRGCACTG；大肠杆菌引物E953r：CGTTAGCTCCGGAAGCCACGCC。探针：双歧杆菌探针B892：FAM-CCGTAAACGGTGGATGCTGGATGTGGGG-BHQ1；乳酸杆菌探针L892：FAM-CCGTAAACGATGARTGCTARGTGTTGGAGGG-BHQ1；大肠杆菌探针E892：FAM-CCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGC-BHQ1。均由上海英骏生物技术有限公司ABI 3900台式高通量DNA合成仪合成。

1.3试验方法50 mg组织研磨成匀浆，提取DNA后，100℃ 10 min，12000 r/min，5 min，立即使用荧光PCR。25 μl体系，94℃ 2 min；94℃5 sec，55℃30 sec，read plate(FAM)，40 cycles，30℃ 5 sec。反应结束后，MJ Opticon2自动分析并计算结果。

2 结果

2.1健康人肠道菌群对数值健康人乙状结肠以上肠段双歧杆菌、乳酸杆菌及大肠杆菌数量对数值分别为8.71±0.44、9.01±0.33、7.01±0.13，乙状结肠以下肠段双歧杆菌、乳酸杆菌及大肠杆菌数量对数值为9.21±0.24、9.02±0.18、7.12±0.21，乙状结肠以上肠段与乙状结肠以下肠段细菌数量无明显差异(P<0.05)。见表1。

2.2 UC患者肠道菌群对数值

2.2.1 UC患者乙状结肠以上肠段与乙状结肠以下肠段菌群比较：双歧杆菌、乳酸杆菌含量均明显降低(P<0.05)，大肠杆菌明显升高(P<0.05)。见表1。

2.2.2 UC患者与健康人肠道菌群比较：UC患者正常肠段与健康人乙状结肠以上及乙状结肠以下肠段比较，双歧杆菌、乳酸杆菌及大肠杆菌数量均无明显差别(P>0.05)；UC患者病变肠段与健康人乙状结肠以上及乙状结肠以下肠段比较，双歧杆菌、乳酸杆菌含量均明显降低(P<0.05)，大肠杆菌明显升高(P<0.05)。见表1。

表1 各组样本中细菌的对数值

3 讨论

每年都有大量的UC患者被新发现和确诊。因为UC的病因及发病机制迄今未明，故缺乏有效的预防及药物彻底治愈的方法，被称为“不是癌症的癌症”，不仅给患者带来极大的身心伤害，而且极大的耗费着社会的医疗资源。弄清UC的发病机制并寻找其有效的治疗手段就成为了当前重要而迫切的任务。

对于UC和肠道菌群之间的关系，目前多数学者认为是肠道菌群的组成、比例等方面的改变导致肠道内微生态环境的变化，从而引起宿主产生异常免疫反应导致UC的发病[1～5]。本研究发现正常人肠道不同部位其双歧杆菌、乳酸杆菌及大肠杆菌数量大致是相当的，说明正常人结肠的菌群比较稳定而且一致，提示在用益生菌疗法时无须考虑结肠肠道菌群差异的问题，全结肠均可以选用相应的益生菌制剂。本研究同时发现，UC患者的病变肠腔粘膜上，双歧杆菌、乳酸杆菌的数量较正常肠腔明显降低，说明病变肠腔粘膜微生态已经严重破坏，这与国外Poxton[6]等人的研究是一致的。但双歧杆菌、乳酸杆菌的数量变化是造成UC疾病的始动因素，还是UC病变破坏肠道粘膜，使得双歧杆菌、乳酸杆菌继发性减少，尚不确定。但本研究亦发现，双歧杆菌、乳酸杆菌减少的同时大肠杆菌却反而升高，考虑UC病变破坏肠道粘膜单单引起双歧杆菌、乳酸杆菌减少的可能性不大，故提示双歧杆菌、乳酸杆菌的数量变化参与UC疾病的发病机制的可能性更大，国外Alexander[7～9]等学者认为正是由于肠道粘膜菌群失调，并且肠粘膜清除细菌的功能受损，使得粪便中致病菌的侵袭性显著增加，促进了局部炎症及免疫紊乱的发生，最终导致UC，故可在此方面进一步研究。本研究发现UC患者的病变肠腔粘膜与正常人肠道粘膜的菌群比较亦存在双歧杆菌、乳酸杆菌数量降低、大肠杆菌升高的特点，提示在益生菌疗法上可先予抗生素杀灭大肠杆菌等致病菌，继而补充双歧杆菌、乳酸杆菌的序贯疗法，则不但可杀灭致病菌，而且有利于双歧杆菌、乳酸杆菌等益生菌避开抗生素使用时期，更易于定植，可进一步进行相关研究。

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