错配修复基因hMLH1在口腔鳞状细胞癌中的表达及意义

谷建琦 王会恩 谢丽丽 张英怀

口腔癌是颌面部最常见的恶性肿瘤，手术是其最主要的治疗方法之一。随着研究的深入，目前认为口腔癌是一种多基因性疾病，其发生通常与一个或数个基因的突变相关，通过基因表达水平或蛋白特性的改变，导致被编码蛋白功能发生异常，干扰细胞的功能，从而加速了肿瘤形成的过程。近年来错配修复基因hMLH1与口腔癌的关系日益受到学者们的瞩目。本研究采用免疫组化方法研究hMLH1在口腔鳞状细胞癌的表达及其意义，探讨hMLH1在口腔鳞状细胞癌发生中的机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 实验组:收集河北医科大学第二医院1991至2004年口腔鳞状细胞癌蜡块标本69例，其中男32例，女37例;年龄13～79岁，平均年龄56.61岁;牙龈癌30例，舌癌19例，颊癌10例，口底癌3例，腭癌7例;高分化34例，中分化20例，低分化15例。所有患者均为术前未经放疗及化疗的初发病例。对照组:正常口腔黏膜组织40例，其中男22例，女18例;年龄11～68岁，平均年龄31.30岁。为囊肿等良性肿瘤旁的正常黏膜组织。以上每例标本均进行HE染色后经有经验的病理医师阅片后确诊。

1.2 试剂 hMLH1及二抗购于武汉博士德生物工程有限公司，使用浓度1∶75。SP免疫组化试剂盒，DAB显色剂，多聚赖氨酸(Poly-L-lysine)防脱片剂均购自北京中山生物技术有限公司。

1.3 方法 采用免疫组织化学SP法。将每个蜡块切为4～5 μm的切片，共切3张，1张HE染色，1张 hMLH1染色，1张作为阴性对照。

1.4 结果判定 hMLH1阳性结果判定:以细胞核或浆内出现棕黄色颗粒者为阳性，结果评定参照Lorenzo Lo Muzio标准［1］，每张切片在光镜下随机选取5个高倍视野，每个视野计数100个癌细胞，观察阳性细胞数，＜5%为阴性(－)，＞5%为阳性(+)。

1.5 统计学分析 应用SPSS 11.5统计软件，计数资料采用χ2检验，出现小值频数时，采用Fisher精确概率法，P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 hMLH1在正常口腔黏膜组织和OSCC组织的表达 在正常口腔黏膜组织中，hMLH1阳性细胞定位于胞浆，呈棕黄色颗粒(图1)，出现于大部分黏膜上皮，部分病例中同时出现胞核着色，呈现为核浆型，着色较浅，且分布均匀。阳性细胞以上皮基底层密集且深染。在OSCC组织中，hMLH1的表达主要位于癌细胞的胞浆内，少部分胞核也有表达，为棕黄色颗粒染色(图2、3)。hMLH1在OSCC组织中的表达率为47.8%，在对照组的表达率为77.5%，而且多为强阳性表达，与实验组的阳性表达率之间差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

图1 正常口腔黏膜组织中hMLH1染色为强阳性(SP×200)

图2 hMLH1在高分化口腔鳞癌组织中的表达(SP×200)

图3 hMLH1在中分化口腔鳞癌组织中的表达(SP×200)

2.2 hMLH1的表达与患者的临床病理学指标的关系 hMLH1的表达与患者的性别、年龄以及肿瘤的部位无明显相关性(P＞0.05)，只与肿瘤的分化程度相关，分化程度越低，hMLH1的失表达越明显(P ＜0.05)。见表2。

3 讨论

错配修复(mismatch repair，MMR)基因是一组高度保守的看家基因，其主要功能是特异性识别和修复DNA复制过程中出现的碱基错配，保证DNA复制的高保真度，维持基因组稳定性。

表1 hMLH1在正常口腔黏膜组织与口腔鳞状细胞癌中的表达 例

表2 hMLH1的表达与患者的临床病理学指标的关系 例

微卫星是广泛散布在整个染色体基因组中的一种特殊的DNA序列，其核心序列为1～6个核苷酸，核心序列可重复8次或更多，串联即构成微卫星。由于微卫星的这个结构特点，所以易于在复制过程中出现“链滑”现象，从而出现错配［2］。若得不到及时纠正，则导致自链与模链板重复单位的重复次数不等，表现为微卫星不稳定性，微卫星不稳定性增加，反映出整个基因组的不稳定状态［3，4］。微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)是错配修复基因缺陷的特征性表现，所谓微卫星不稳定是指由于复制错误引起的简单重复序列的改变。正常情况下，DNA在复制过程中经常会发生错误，但会被细胞自身的防卫机制如错配修复基因所纠正，不会影响基因的正常结构。而在疾病状态下(如肿瘤)，细胞内错配修复基因发生突变，直接造成错配修复机理的破坏，进而发生MSI，最终可能发生基因结构上的变化，从而导致肿瘤。

Lorenzo等［1］用免疫组化的方法分析20例口腔鳞状细胞癌及5例正常口腔黏膜组织中hMLH1的表达，结果5例正常口腔黏膜组织均为阳性表达，在基底细胞层和基底旁细胞层核染色强阳性，角化层无染色，并且2例伴有浆染色。而在口腔磷状细胞癌中，hMLH1有10例核染色。研究认为，hMLH1蛋白表达的检测在口腔鳞状细胞癌的检测中发挥重要的作用，hMLH1的缺失可能为口腔鳞状细胞癌的潜在特点。

本研究结果显示:在40例正常口腔黏膜中有31例hMLH1为强阳性表达，为胞浆染色，并且在基底细胞层和基底旁细胞层显示为强染色，而在表皮层无染色。而在69例口腔鳞状细胞癌中，hMLH1有33例阳性表达，且为浆染色，这与Lorenzo有所不同，并且本实验无论正常对照组还是试验组的阳性率均较文献［1］低，考虑与所取样本数目多少有极大关系，还可能与肿瘤的组织分型、免疫组化技术等多种因素有关。

本实验阳性率与年龄、性别及部位无关，只与分化程度相关，随分化程度的降低，hMLH1的表达有降低趋势，在低分化口腔鳞状细胞癌中基本无表达。这在口腔鳞状细胞癌的研究中未见相关报道，有关其它肿瘤的文献报道不一。

Shin等［5］研究认为，微卫星不稳定性在口腔鳞状细胞癌和涎腺肿瘤的发生发展中发挥重要的作用，hMLH1遗传基因的改变或hMLH1促甲基化可能是口腔鳞状细胞癌发生发展的原因。Viswanathan等［6］也认为，hMLH1的促甲基化导致失活在口腔鳞状细胞癌中比较常见，异常甲基化的检测可作为诊断OSCC的高危险因素。

Han等［7］发现低分化腺癌中MSI阳性率为64%，高分化腺癌中MSI阳性率为17%，低分化腺癌中MSI发生率显著高于高分化腺癌，这与本实验结果一致。但Kruschewski等［8］在研究SCC时发现hMLH1与hMSH2蛋白表达缺失与肿瘤的分化程度及淋巴结转移无关。

在本研究中，我们从错配修复缺陷的角度探讨了口腔鳞状细胞癌的发生发展机制，这有助于我们进一步了解MMR的生理功能及其对细胞增殖与凋亡的调节作用等生物学行为，以及在人类肿瘤发生中的机制，但hMLH1对口腔鳞状细胞癌发生的作用大小，所处的地位及与其它诸多基因改变的复杂关系等尚不完全清楚，还有待于进一步研究。

1 Lorenzo LM，Pierfrancesco N，Michele D，et al.Immunocytochemical detection of hMSH2 and hMLH1 expression in oral SCC.Anti Res，1999，19:933-940.

2 丁一，童坦军.微卫星不稳定性的生物学意义及其应用前景.生理科学进展，1999，30:292-296.

3 Fleisher AS，Esteller M，Wang S，et al.Hepermethylation of hMLH1 gene promoter in human gastric cancers with microsatellite instability.Cancer Res，1999，59:1090-1095.

4 Halling KC，Harper J，Moskaluk CA，et al.Origin of microsatellite instability in gastric cancer.Am J Pathl，1999，155:205-211.

5 Shin KH，Park KH，Hong HJ.Prevalence of microsatellite instability，inactivation of mismatch repair genes，p53 mutation，and human papillomavirus infection in Korean oral cancer patients.Int J Oncol，2002，21:297-302.

6 Viswanathan M，Tsuchida N，Shanmugam G.Promoter hypermethylation profile of tumor-associated genes p16，p15，hMLH1，MGMT and E-cadherin in oral squamous cell carcinoma.Int J Cancer，2003，105:41-46.

7 Han HJ，Yanagisawa A，Kato Y，et al.Genetic instability in pancreztic cancer and poorly differentiated type of gastic cancer.Cancer Res，1993，53:5087-5089.

8 Kruschewski M，Noske A，Haier J，et al.Is reduced expression of mismatch reqair genesmlH1 and MSH2 in patients with sporadic colorectal cancer related to their prognosis.Clin Exp Metastasis，2002，19:71-77.