HPLC法测定克拉霉素片含量的不确定度分析

苗爱东 杨 静 王彦宗

北京军区联勤部药品仪器检验所，北京 100071

克拉霉素片为《中国药典》2010年版二部收载品种[1]，属大环内酯类药物，临床上常用于鼻咽感染、下呼吸道感染、皮肤软组织感染、急性中耳炎、肺炎支原体肺炎、军团菌感染、沙眼衣原体引起的尿道炎及宫颈炎等的治疗[2]。克拉霉素片的含量测定方法为HPLC外标一点法[1]，本文根据《测量不确定度评定与表示》（JJFl059-1999）、《化学分析测量不确定度评定》（JJF1135-2005）和《化学分析中不确定度的评估指南》（CNAS-GL06：2006）中有关规定[3-5]，对HPLC法测定克拉霉素片含量的测量不确定度进行了评估，以期找出影响不确定度的各种因素，为客观评价克拉霉素片的检验结果提供科学依据。

1 克拉霉素片的含量测定方法

1.1 色谱条件与系统适用性试验

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸盐缓冲液（pH 5.5）-乙腈（600∶400）为流动相；检测波长为210 nm；柱温45℃。理论板数按克拉霉素峰计算不低于3 000；拖尾因子不得过2.0；克拉霉素峰与相邻杂质峰的分离度符合要求。

1.2 对照品溶液的配制

精密称取克拉霉素对照品（中国药品生物制品检定所，批号130558-200902，纯度97.9%）适量，置50 mL量瓶中，用流动相溶解并定量稀释制成每毫升中约含0.35 mg的溶液。

1.3 供试品溶液的配制

取本品10片（丽珠集团丽珠制药厂，0.25 g/片），精密称定，研细，精密称取细粉适量（约相当于克拉霉素35 mg）置100 mL量瓶中，加流动相充分振摇使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

1.4 测定方法与数据分析

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，记录对照品溶液和供试品溶液的峰面积，按外标法以色谱峰面积计算，即得[1]。实验结果记录见表1。

计算公式：X=〔（As×Wr×P×Vs×M） / （Ar×Vr×10×Ws×K标）〕×100%。式中：

X：克拉霉素的标示量（%）；

As：供试品溶液的峰面积；

Ar：对照品溶液的峰面积；

Wr：对照品称样量；

Ws：供试品称样量；

P：对照品的纯度；

Vr：对照品稀释倍数；

Vs：样品稀释倍数；

M：10片克拉霉素重量；

K标：克拉霉素片剂的标示量（0.25g）。

2 不确定度的量化分析

2.1 对照品引起的不确定度

2.1.1 对照品纯度引起的相对不确定度 属B类不确定度。克拉霉素对照品由中国药品生物制品检定所提供，批号：130558-200902，纯度97.9%，使用前无需干燥处理，未给出限度标识，其相对不确定度可视为0。

2.1.2 对照品称量引起的相对不确定度 电子分析天平校准的不确定度分析：使用METTLER TOLEDO AG 285双量程电子分析天平（d=0.01 mg），检定证书列出的最大允差△为±0.03 mg，属B类不确定度，按矩形分布，其标准不确定度为0.03/31/2=0.017 3 mg。

电子分析天平称量重复性的不确定度分析：使用的电子分析天平（d=0.01 mg），检定证书列出的重复性误差为±0.05 mg，属B类不确定度，按矩形分布，其标准不确定度为0.05/31/2=0.028 9 mg；单次称量的标准不确定度为：（0.017 32+0.028 92）1/2=0.033 7 mg，因为称量过程使用的是减重法，其不确定度为：（2×0.033 72）1/2=0.047 7 mg。

对照品双样称量的相对标准不确定度分别为：0.047 7/18.45=2.59×10-3和0.074 8/16.86=2.83×10-3，故对照品称量的相对标准不确定度为： [（2.59×10-3）2+（2.83×10-3）2]1/2=3.83×10-3。

表1 实验结果记录表

2.1.3 对照品稀释引起的相对标准不确定度 查阅《常用玻璃量器检定规程》JJG196-2006[6]，A级50 mL规格容量瓶的体积允差△为±0.05mL，属B类不确定度，按三角分布，其相对不确定度为：0.05/（61/2×50）=4.08×10-4。

容量瓶体积重复性不确定度：对50 mL容量瓶加水至刻度后称量，重复10次操作，得出的标准偏差为0.008 2 mL，属A类不确定度，其相对不确定度为：0.082/50 =1.64 ×10-4。

温差引起的不确定度：由玻璃仪器制造商提供的信息，50 mL容量瓶在20 ℃下校准，实验室环境实测温度为26 ℃，属B类不确定度，按矩形分布，在95%置信概率下，其相对不确定度为：6×2.1×10-4×50/（31/2×50）=7.27×10-4。

对照品溶液稀释引起的相对不确定度：[（4.08×10-4）2+（1.64×10-4）2+（7.27×10-4）2]1/2=8.50×10-4。

2.2 供试品引起的不确定度

2.2.1 供试品称量引起的相对不确定度 电子分析天平校准的不确定度分析：使用的电子分析天平（d=0.01 mg），检定证书列出的最大允差△为±0.03 mg，属B类不确定度，按矩形分布，其标准不确定度为0.03/31/2=0.017 3 mg。

电子分析天平称量重复性的不确定度分析：使用的电子分析天平（d=0.01 mg），检定证书列出的重复性误差为±0.05 mg，属B类不确定度，按矩形分布，其标准不确定度为0.05/31/2=0.028 9mg。单次称量的标准不确定度为：（0.017 32+0.028 92）1/2=0.033 7 mg，因为称量使用的是减重法，其不确定度为：（2×0.033 72）1/2=0.047 7 mg。

供试品双样称量的相对标准不确定度分别为0.047 7/63.70=7.49×10-4和0.047 7/63.50=7.51×10-4，故供试品称量的相对标准不确定度为：[（7.49×10-4）2+（7.51×10-4）2]1/2=1.06×10-3。

2.2.2 供试品稀释引起的相对标准不确定度 查阅《常用玻璃量器检定规程》JJG196-2006[6]，A级100 mL规格容量瓶的体积允差△为±0.10 mL，属B类不确定度，按三角分布，其相对不确定度为：0.10/（61/2×100）=8.16×10-4。

容量瓶体积重复性不确定度：对100 mL容量瓶加水至刻度后称量，重复10次操作，得出的标准偏差为0.015 mL。属A类不确定度，其相对不确定度为：0.015/100=1.50×10-4。

温差引起的不确定度：由玻璃仪器制造商提供的信息，100 mL容量瓶在20℃下校准，实验室环境实测温度为26℃，属B类不确定度，按矩形分布，在95%置信概率下，其相对不确定度为：（6×2.1×10-4×100）/（31/2×100）=7.27×10-4。

供试品溶液稀释引起的相对不确定度：[（8.16×10-4）2+（1.50×10-4）2+（7.27×10-4）2]1/2=1.10×10-3。

2.3 对照品溶液进样重现性的不确定度

精密称取2份克拉霉素对照品，分别配成对照品溶液，每份溶液重复进样3次，得到6个色谱峰面积数据，属A类不确定度，为随机测量，结果见表1。双份对照品溶液各自的相对不确定度分别为 1.5/368.7=3.95×10-3和 1.2/333.6=3.58×10-3，故对照品溶液进样的相对不确定度为[（3.95×10-3）2+（3.58×10-3）2]1/2=5.33×10-3。

2.4 供试品溶液进样重现性的不确定度

精密称取2份克拉霉素片供试品，分别配制成供试品溶液，每份溶液重复进样2次，得到4个色谱峰面积数据，结果用极差法计算，取n=2时极差系数C=1.13，记录双样测量峰面积为：356.7、358.5；351.3、350.8；则：S1=（356.7+358.5）/2=357.6，r=1.8；S2=（351.3+350.8）/2=351.1，r=0.5。

则相对标准不确定度为：{[1.8/（1.13×357.6）]2+[0.5/（1.13×351.1）2]}1/2=4.63×10-3。

2.5 平均片重称量引入的不确定度

电子分析天平校准的不确定度分析：使用的电子分析天平（d=0.01 mg），检定证书列出的最大允差△为±0.03 mg，属B类不确定度，按矩形分布，其标准不确定度为0.03/31/2=0.017 3 mg。

电子分析天平称量重复性的不确定度分析：使用的电子分析天平（d=0.01 mg），检定证书列出的重复性误差为±0.05 mg，属B类不确定度，按矩形分布，其标准不确定度为0.05/31/2=0.028 9 mg。单次称量的标准不确定度：（0.017 32+0.028 92）1/2=0.033 7 mg，因为称量过程使用的是减重法，其不确定度为：（2×0.033 72）1/2=0.047 7 mg。

供试品平均片重称量的相对标准不确定度为0.047 7/456.3=1.05×10-4。

2.6 不确定度各分量及分析

不确定度各分量及分析结果见表2。

表2 不确定度各分量的分析结果

2.7 合成相对标准不确定度

合成相对标准不确定度为：[（3.83×10-3）2+（8.50×10-4）2+（5.33×10-3）2+（1.06×10-3）2+（1.05×10-4）2+（1.10×10-3）2+（4.63×10-3）2]1/2=8.22×10-3。

合成标准不确定度为：8.22×10-3×100.1%=0.82%。

2.8 扩展不确定度

取包含因子k=2，则扩展不确定度为：2×0.82% =1.6%。

则克拉霉素片含量测定结果可表示为： 100.1%±1.6%， k=2。

3 讨论

不确定度的评定是一份完整的药品检验报告书应包括的内容，任何检验方法都不可避免地会引入不确定度。不确定度对检测结果临界值的判断和检验方法的确认等具有十分重要的意义。由上述不确定度的分析评定结果可知，HPLC法测定克拉霉素片含量的不确定度主要来自液相色谱仪的进样、对照品的称量和供试品溶液的配制等环节，其中由对照品溶液和供试品溶液色谱分析进样环节的不确定度之和占不确定度总和的60%，提示在采用HPLC法测定克拉霉素片的含量时，应确保液相色谱仪的技术性能指标与被测药品的有关参数要求相适应，定期做好液相色谱仪的计量检定和期间核查工作，使其始终处于良好稳定的工作状态；同时要严格按照药典标准规定的要求取样，选用精度符合要求的分析天平称量，不能只为节约检验成本和操作方便而随意减少对照品和供试品的取样量，尽可能减少操作的随意性和人为因素对检验结果造成的不利的影响。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010：153.

[2]陈新谦，金有豫，汤光.新编药物学（第15版）[M].北京：人民卫生出版社，2003：89.

[3]JJF1135-2005.化学分析测量不确定度评定[S].北京：中国计量出版社，2005.

[4]JJFl059-1999.测量不确定度评定与表示[S].北京：中国计量出版社，1999.

[5]CNAS-GL06.化学分析中不确定度的评估指南[S].北京：中国计量出版社，2006.

[6]JJG196-2006.常用玻璃量器检定规程[S].北京：中国计量出版社，2006.