针药并用对帕金森病模型小鼠纹状体DA、NE和5-羟色胺影响

陆征宇,赵虹,陈洁,程波,宗蕾



针药并用对帕金森病模型小鼠纹状体DA、NE和5-羟色胺影响

陆征宇,赵虹,陈洁,程波,宗蕾

(上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院,上海 200437)

观察平颤解郁方配合针刺治疗对帕金森病模型小鼠纹状体DA、NE和5-HT等神经递质的影响。将成年C57/BL雄性小鼠28只随机分为正常组、模型组、西药组和针药组4组,每组7只。采用高效液相色谱-电化学检测法,测定各组小鼠纹状体DA、NE和5-羟色胺(5-HT)的含量。模型组、西药组和针药组小鼠纹状体DA、NE、5-HT含量均显著低于正常组(＜0.01,＜0.05),西药组和针药组小鼠纹状体DA、NE、5-HT含量显著高于模型组(＜0.01,＜0.05)。平颤解郁方配合针刺治疗可提高纹状体下降的DA、NE、5-HT水平。

针刺;电针;帕金森病;大鼠;平颤解郁方;针药并用

帕金森病(parkinson disease,PD)是一种中老年常见的神经变性疾病,选择性神经递质的降低可能是产生PD的危险因素之一。目前研究认为,黑质纹状体系统以多巴胺为代表的单胺类神经递质的减少是PD的一个重要病理生理特征。我们通过既往的临床研究,发现平颤解郁方结合针灸治疗具有较好的治疗效果,能有效改善PD症状。本研究以C57/BL雄性小鼠为实验动物,探讨平颤解郁方配合针刺治疗对PD小鼠纹状体内多巴胺(dopamine,DA)、去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)、5-羟色胺(5-hydroxytryp- tamine,5-HT)等神经递质水平的影响,从而为临床研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

雄性8周龄C57/BL小鼠28只,体重20～25 g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,随机分为正常组、模型组、西药组和针药组4组,每组7只。

1.2 药物制备

将熟地、生地、白芍、钩藤、柴胡、制首乌、川芎等,根据文献[1]方法制成2.0 g/mL水煎液,4℃保存备用。将左旋多巴/苄丝肼配制成相当于临床等效剂量10倍的水溶液,得2.5 mg/mL溶液,随配随用。

1.3 主要试剂及仪器

1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)、多巴胺盐酸盐、去甲肾上腺素盐酸盐、5-羟色胺盐酸盐(美国Sigma公司)。LC210A型高效液相色谱仪(日本SHIMADZU)、Waters460电化学检测器(美国Waters公司)、Hypersil ODS23柱(日本GL公司)、保护柱(DIKMA公司)、MicroMax RF高速离心机(国际仪器公司IEC)、LXJ2 ⅡB低速离心机(上海安亭科学仪器厂)。华佗牌无菌针灸针0.40 mm×25 mm毫针(苏州医疗用品厂有限公司),G6805-2型电针仪(上海医用电子仪器厂)。

1.4 动物模型制备

参照国内外较为公认的MPTP腹腔注射的方法[2]复制PD小鼠模型。随机分组的小鼠适应环境10 d后开始给药,其中模型组、西药组、针药组用生理盐水溶解MPTP后,按30 mg/kg腹腔注射MPTP,每日1次,连续注射7 d,制备PD小鼠模型;正常组腹腔注射相应量生理盐水,每日1次,连续注射7 d。

1.5 动物处理

模型复制后,各组动物分别给予相应的治疗,每日1次,治疗14 d。正常组给予生理盐水灌胃(0.1 mL/ 10 g);模型组给予生理盐水灌胃(0.1 mL/10 g);西药组给予左旋多巴/苄丝肼灌胃(0.1 mL/10 g);针药组给予针刺百会、风府、阳陵泉三穴,毫针针刺后接G6805-2型电针仪,连续波,频率为2 Hz,电流强度1 mA,刺激15 min及平颤解郁方灌胃(0.1 mL/10 g)。小鼠在最后一次相应处理后,禁食、禁水,次日断头处死, 1 min内开颅取出全脑,在冰盘上解剖,准确分离取出纹状体组织,立即转入－70℃冰箱内保存待测。

1.6 指标检测

采用高效液相色谱-电化学检测法。取纹状体组织匀浆,加正丁醇210 mL,混匀,于4℃下离心(10000 ×)15 min。取上清液,加0.11 mol/L HClO40.150 mL、正庚烷210 mL,旋涡振荡3 min后低速离心(3000 ×)3 min。除去有机相,在下层的水相中加CHCl3210 mL,经旋涡振荡3 min、低速离心3 min后,取上层水样直接进样,进样量20.0mL。流动相为缓冲液(0.102 mol/L柠檬酸三钠和0.105 mol/L磷酸氢二钠):甲醇=90:10的溶液,经0.145mm滤膜过滤并超声脱气后使用,流速为110 mL/min。工作电极为玻璃碳电极,参比电极Ag/AgCl,电化学监测器设定电压为＋650 mV。共测定3种单胺类神经递质,其洗脱顺序依次为NE、DA、5-HT。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 四组模型复制后行为

正常组小鼠在实验过程中反应灵敏,摄食正常,无明显异常表现。模型组、西药组和针药组小鼠在应用MPTP腹腔注射后都出现了不同程度动作减少、重复点头、间歇性闭眼、向一侧旋转,噪声或痛刺激后仅有睁眼凝视或惊恐反应、竖毛、频繁窜蹦等急性海洛因样反应,这些反应在第2次腹腔注射MPTP后2～5 min内产生,每次发作持续约5～30 min。注射MPTP第2天起小鼠逐渐出现暂时性(2～3 h)肢体行动迟缓、躯干震颤、动作减少、竖毛、尾巴过伸及爬杆试验障碍,注射MPTP第6～7天上述表现最为显著。模型组、西药组和针药组小鼠经治疗行为逐渐恢复,但是部分西药组小鼠在治疗第13天起又出现运动障碍,表现为反复咀嚼、强制性啃咬。

2.2 四组纹状体内DA、NE、5-HT含量变化

由表1可见,模型组、西药组、针药组DA含量均低于正常组(＜0.01,＜0.05),西药组、针药组DA含量高于模型组(＜0.01),西药组与针药组DA含量差异无统计学意义(＞0.05)。模型组、西药组、针药组NE含量均低于正常组(＜0.01),西药组、针药组NE含量高于模型组(＜0.01),西药组与针药组NE含量差异无统计学意义(＞0.05)。模型组、西药组、针药组5-HT含量均低于正常组(＜0.01,＜0.05),西药组、针药组5-HT含量高于模型组(＜0.05),西药组与针药组5-HT含量差异无统计学意义(＞0.05)。

表1 四组小鼠纹状体DA、NE、5-HT含量水平(±s,ng/g)

注:与正常组比较1)＜0.01,2)＜0.05;与模型组比较3)＜0.01,4)＜0.05

3 讨论

帕金森病临床主要表现为静止性震颤、肌强直、动作迟缓和姿势平衡障碍等症状。DA、NE和5-HT等神经递质的异常在帕金森病的发病中起着一定的作用[3-7]。PD最显著的生物化学特征是脑内DA含量减少。一般认为,当基底节中DA含量减少到70%以上时才出现临床症状,运动迟缓和强直与黑质-纹状体DA含量减少有直接关系[8]。NE、5-HT在纹状体中的含量也相当高,在PD时,纹状体区的NE含量轻度至中度降低,5-HT含量亦有所下降。

用MPTP所建立的PD小鼠模型是目前较为理想的PD模型[9]。MPTP本身并无毒性,其进入体内在胶质细胞单胺氧化酶B作用下转变为甲基-苯基-双氢吡啶,然后进一步转化为甲基-苯基吡啶离子(MPP＋),MPP＋被DA转运体主动摄取到DA神经元胞体内,再进入线粒体,抑制线粒体呼吸链复合体Ⅰ的活性,使ATP合成减少,自由基生成增加,同时MPP＋还可以使细胞内乳酸堆积、Ca2＋平衡紊乱、一氧化氮合成增加、谷胱甘肽合成减少,这些因素均可加剧自由基的过度生成,降低细胞对自由基损伤的抵抗能力,最终导致DA能神经元变性、死亡[10,11]。另外,MPTP对NE能和5-HT能神经元也有一定的毒性作用,其机理尚不明确。

腹腔注射MPTP后小鼠产生急性海洛因样反应可能是与MPTP对NE、5-HT的系统功能和阿片受体活性的影响有关。同时发现在连续给予左旋多巴治疗一段时间后,小鼠会产生明显的运动障碍。以往的研究认为这与长期应用多巴药物后纹状体D2受体过度激活有关。近期有研究认为这可能与纹状体突触后膜DA受体的波动性刺激有关,这种非生理性刺激破坏了基底节的功能网络。由于纹状体DA神经末梢受损,对纹状体DA浓度的缓冲能力下降,短效左旋多巴血浆浓度的波动可能被直接传输到纹状体,纹状体DA受体受到纹状体DA“脉冲”样刺激,细胞内基因和蛋白表达失调、基底节输出神经元放电模式改变,最终产生运动障碍。

帕金森病属于中医学“颤证”、“脑病”等范畴,根据PD的临床表现,中医学认为其基本病机是肝肾阴虚,患者常在肝肾不足的基础上并发肝气郁结,是病机的演变或夹杂;PD多为本虚标实之证,肝肾不足是为病之本,肝气郁结乃为病之标,治疗当标本同治,扶正与祛邪兼施,治疗原则是补益肝肾,疏肝解郁。本实验所用平颤解郁方系在长期临床中反复调整筛选,该方熟地、生地补益肝肾为君药,白芍、钩藤柔肝熄风,柴胡疏肝解郁为臣药,制首乌补益肝肾、川芎行气解郁为佐药,全方共奏补益肝肾、疏肝解郁之效。我们的临床研究发现平颤解郁方对各期PD患者均有一定疗效,能改善PD患者的运动症状和抑郁、便秘、乏力等非运动症状,可减少左旋多巴的用量,减少其副反应。本实验中针刺选用百会、风府、阳陵泉组方。中医学认为PD的病位在脑。《素问·骨空论》:“督脉者……上额交巅上……入络脑”,“病变在脑,首取督脉”;百会为手足三阳经与督脉之会穴,位居于巅顶之上,开窍通络止颤,又补下元虚损,健脑宁神,疏泻肝风。风府穴为督脉经的腧穴,为治风之要穴。《行针指要赋》:“或针风,先向风府,百会中。”风府穴又为督脉经、阳维脉的交会穴,督脉走行到风府处,便入颅内,与脑府连系。《难经·二十八难》:“督脉者……上至风府,入属于脑。”两穴相配共奏通调脑络,祛风止颤之功。现代研究认为,帕金森患者的全脑血流量都有下降,针刺可以增加脑血流量,从而改善脑部的血液循环,头穴对脑血流的作用迅速而持久,这可否防止或延缓多巴胺能神经元变性,尚待进一步研究证实。阳陵泉是筋之会穴,为筋气聚会之处。《难经·四十五难》:“筋会阳陵泉。”主治筋病,舒筋活络,能解全身之颤动。而且研究发现[12],针刺曲池、阳陵泉两穴位可使病人脑血管扩张,血流速度加快,明显改善脑供血的情况,加速病灶侧大脑组织细胞的恢复。本研究发现,经治疗,针药组和西药组小鼠纹状体DA、NE、5-HT含量显著高于模型组。

综上所述,平颤解郁方配合针刺治疗能够使PD小鼠纹状体下降的DA、NE、5-HT水平升高,改善PD症状,且未见明显不良反应,其详细的机制有待进一步研究。

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Effect of Combined Acupuncture and Medicine on Striatal DA, NE and 5-hydroxytryptamine in a Mouse Model of Parkinson Disease

-,,,,.

,2000437,

To investigate the effect of tremor and depression-relieving prescription plus acupuncture on striatal neurotransmitters DA, NE and 5-HT in a mouse model of Parkinson disease.Twenty-eight adult male C57/BL mice were randomly allocated to four groups: normal, model, Western drug and combined acupuncture and medicine, 7 mice each. Striatal DA, NE and 5-hydroxytryptamine (5-HT) contents were measured by high efficiency liquid chromatography-electrochemical determination in every group of mice.Striatal DA, NE and 5-hydroxytryptamine (5-HT) contents were significantly lower in the model, Western drug and combined acupuncture and medicine groups of mice than in the normal group (＜0.01,＜0.05) and significantly higher in the Western drug and combined acupuncture and medicine groups of mice than in the model group (＜0.01,＜0.05).Tremor and depression-relieving prescription combined with acupuncture can raise low striatal DA, NE and 5-HT levels.

Acupuncture; Electroacupuncture; Parkinson disease; Mouse; Tremor and depression-relieving prescription; Combined use of acupuncture and medicine

1005-0957(2011)01-0056-03

R2-03

A

10.3969/j.issn.1005-0957.2011.01.056

2010-10-28