两种稀释液对荷斯坦奶牛和夏洛莱肉牛冷冻精液的影响

张茂华，刘晓妮，李志军

（1.山西省畜牧遗传育种中心，太原 030027；2.山西省生态畜牧产业管理站，太原 030001；山西农业大学动科院）

家畜精液保存技术是一项先进的动物繁殖技术，它是随着人工授精技术的广泛运用而产生的，是人工授精技术的重大革新。在温度变化过程中，精清对精子的保护能力是有限的，为了延长精子在体外的存活时间和受精力，便于保存和运输，常向精液中加入适宜精子存活的稀释液。稀释液是精子的保护剂，其成分和含量必须符合精子的生物学特性和低温保护性能。本试验选择一种国外稀释液和我国普遍应用的稀释液进行比较，以评定不同稀释液对牛冷冻精液品质的影响，对牛冷冻精液新型稀释液的开发和牛冷冻精液品质的提高具有一定的现实意义。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂 进口稀释液：某国进口稀释液，200mL/瓶。自配稀释液：果糖，三羟甲基氨基甲烷（Tris），甘油，柠檬酸，卵黄（新鲜鸡蛋中取），青霉素，链霉素，双蒸馏水。

1.1.2 仪器 法国卡苏公司进口的细管精液设备，冰箱，电子天平，电热恒温干燥箱，电热恒温水浴锅，普通显微镜，移液器，血细胞计数板，计数器，离心机，液氮罐，牛用采精器械，电子恒温板。

1.1.3 稀释液的配置 稀释液Ⅰ（国产稀释液）：第1液，双蒸水73mL、三羟甲基氨基甲烷2.42 g、柠檬酸1.34 g、果糖1 g、甘油7mL，混合热溶灭菌30 min；第2液，取第1液80mL，加入新鲜卵黄20mL、青霉素16万u、链霉素10万u。

稀释液Ⅱ（进口稀释液）：取进口稀释液20mL，加入双蒸水80mL，混合均匀。

1.2 方法

1.2.1 采精与精子质量评定 2010年在山西省家畜冻精中心选取10头体格健康、性欲旺盛、采过精液的种公牛，其中包括5头荷斯坦公牛和5头夏洛莱公牛。实验室镜检鲜精活率、活率、密度和畸形率；鲜精质量要求：精子浓度大于6亿/mL，活率大于0.7，畸形率小于10%。合格精液方可用于冷冻。

1.2.2 精液稀释 将每份合格精液立即将其平均分成2等份，放在2个大试管中，分别用2种稀释液按相同的稀释倍数进行稀释。

用稀释液Ⅰ和Ⅱ稀释的精液，放在4℃低温柜中平衡4 h。

1.2.3 精液的分装和冷冻 平衡后的稀释精液，用分装机吸入有标识（如牛号等）的塑料细管内并封口。把参试牛的细管均匀摆放到同一金属架上，以保证冷冻环境的一致，每架摆放175支细管。摆有细管的金属架放入冷冻箱中冷冻，当细管的温度降到-140℃时，把细管浸入液氮中待用。

1.2.4 精液的解冻 每头牛每种稀释液的细管精液取3支，浸泡到39℃的温水中解冻，待精液完全融化时马上从温水中拿出，擦干水迹待检。

1.2.5 精子质量检测

1）精子活率检查：3支细管分别直接置于39℃水浴中解冻，取解冻3支混合后精液约50 μL置于载玻片上加盖玻片，立即在载物台保持38℃的情况下用200～400倍显微镜观察活率，也可通过电视显微装置在荧光屏上观察活率。每样片观察3个视野，并应观察不同液层内的精子运动状态，进行全面评定。

3）畸形率（包括顶体完整率）的测定：姬姆萨染色法：①抹片：取1～2滴精液滴于载片一端，用另一边缘光滑的玻片与有样品的玻片呈35度，将样品均匀涂抹于载玻片上，自然风干（约15 min）。②固定：在风干抹片上滴1～2mL中性福尔马林固定液，固定15 min后用清水缓缓冲去固定液，吹干或自然干燥。③染色：将干燥的固定后的抹片反扣在带有平槽的有机玻璃板面上，把姬姆萨染色液滴于槽和抹片之间，让其充满平槽并使抹片接触染液，染色1.5 h后用清水缓缓冲去染液，晾干待检。④镜检：将制备好的抹片在400倍显微镜下观察精子畸形率；而顶体完整率是在抹片上滴一滴香柏油，置于400倍显微镜下观察。⑤每样品制作两个抹片，每抹片观察300个精子以上（分左右两个区），取两片的平均值，两片的变异系数不得超过20.0%。

1.2.6 统计分析 采用SPSS 13.0统计软件进行t检验。

2 结果与分析

2.1 两种稀释液对荷斯坦奶牛和夏洛莱肉牛精液解冻后活率的影响 给定显著性水平α=0.05，由t值表查得t0.05（8）=2.306。由表 1 可知，对两种稀释液稀释 HS（荷斯坦牛）牛精液解冻后的成活率进行t检验，|t|=0.307＜2.306，表明所采用的两种稀释液处理HS牛精液解冻后的成活率差异不显著（P＞0.05）；对两种稀释液稀释XL（夏洛莱肉牛）精液解冻后的成活率进行t检验，|t|=0.069＜2.306，表明所采用的两种稀释液处理XL牛精液解冻后的成活率差异不显著（P＞0.05）。

表1 两种稀释液对荷斯坦奶牛和夏洛莱肉牛精液解冻后活率的影响%

2.2 两种稀释液对荷斯坦奶牛和夏洛莱肉牛精液解冻后畸形率的影响 给定显著性水平α=0.05，由t值表查得 t0.05（8）=2.306。由表 2可知，对两种稀释液稀释 HS牛精液解冻后畸形率进行t检验，|t|=0.223＜2.306，表明所采用的两种稀释液处理HS牛精液解冻后畸形率差异不显著（P＞0.05）；对两种稀释液稀释XL牛精液解冻后畸形率进行t检验，|t|=0.039＜2.306，表明所采用的两种稀释液处理XL牛精液解冻畸形率差异不显著（P＞0.05）。

表2 两种稀释液对荷斯坦奶牛和夏洛莱肉牛精液解冻后畸形率的影响%

2.3 两种稀释液对荷斯坦奶牛和夏洛莱肉牛精液解冻后顶体完整率的影响 给定显著性水平α=0.05，由t值表查得t0.05（8）=2.306。由表3可知，对两种稀释液稀释HS牛精液解冻后顶体完整率进行t检验，|t|=2.368＞2.306，表明所采用的两种稀释液处理HS牛精液解冻后顶体完整率差异显著；对两种稀释液稀释XL牛精液解冻后顶体完整率进行t检验，|t|=3.150＞2.306，表明所采用的两种稀释液处理XL牛精液解冻后顶体完整率差异显著（P＜0.05）。

表3 两种稀释液对荷斯坦奶牛和夏洛莱肉牛精液解冻后顶体完整率的影响%

3 讨论与分析

卵黄因含有卵磷脂，能稳定精子细胞膜，防止顶体破裂；其融点低，在低温下不易被冻结，加入精液后可透入精子内代替缩醛磷脂而被利用，故可保护精子防止冷休克的发生。Moussa等［1］认为，卵黄中的低密度脂蛋白（LDL）在精子冷冻过程中可抵御低温打击，提高精子活率、顶体完整率和质膜完整性。目前，对卵黄的研究还在继续，Andrabi等［2］试验证实，添加鸭卵黄冷冻水牛精液效果明显好于其它禽类卵黄。

但是，卵黄应用于稀释液中存在一定的弊端：卵黄内可能存在着病原菌，会在稀释液的携带下传播，影响动物冷冻精液在国际和国内的种质交流；此外，在有氧条件下，卵黄中的某些氨基酸在酶作用下，可能产生对精子有害的过氧化氢。考虑到这些不利因素，国外一些国家在稀释液中已经不使用卵黄、牛奶这类动物源性添加物，正流行着用大豆卵磷脂取代卵黄，以避免卵黄中病原体的传播。Leeuw等［3］和Thun等［4］分别用大豆提取物的稀释液处理牛精液，效果都不理想，不返情率显著低于对照组。Moussaa等［1］、胡建宏等［5］均报道利用 LDL代替卵黄在牛和猪上冷冻精液效果比商业用的稀释液好。

从试验结果来看，稀释液Ⅰ和稀释液Ⅱ对奶牛和肉牛冷冻精液的活率和畸形率影响不大，但是使用稀释液Ⅰ稀释的奶牛和肉牛精液的顶体完整率显著高于使用稀释液Ⅱ稀释的奶牛和肉牛精液的顶体完整率。

进口稀释液无卵黄不含动物源成分，稀释后的精液细菌数少，降低了精液的污染风险，使用简单，用蒸馏水稀释即可使用。但购买成本昂贵。保存周期长。极易因保存条件变化而影响使用效果。而国产稀释液取材简单，可以随配随用，而且成本相比较低。虽操作略繁琐一些，但顶体完整率略占优势，有好的受胎率，也是一种很好的稀释液配方。对未来开发新的稀释液配方有一定的指导意义。

［1］MoussaM，MartinetV，Trimeche，etal.Low densitylipoproteins extracted from hen egg yolk by an easy method：cryoprotective effect on frozen-thawed bullsemen［J］.Theriogenology，2002，57（6）：1695-1706.

［2］Andrabi S M，Ansari M S，Ullah N，et al.Duck egg yolk in extender improves the freezability of buffalo bull spermatozoa［J］.Animal Reproduction Seience，2008，104（2）：427-433.

［3］Leeuw，Haring，Kaal-Lansbergen，et al.Fertility results using bovine semen cryopreserved with extenders based on egg yolk and soy bean extract［J］.Theriogenology，2000，54（4）：57-67.

［4］Thun，Maria Hurtado，Janett，et al.Comparison of Biociphos-Plus and TRIS-egg yolk extender for cryopreservation of bull semen［J］.Theriogenology，2002，57（3）：1087-1094.

［5］Jian-hong Hu，Qing-wang Li，Gang Li.The cryoprotective effect on frozen-thawed boar semen of egg yolk low density lipoproteins［J］.Asian-Aust J Anim Sci，2006，19（4）：486-494.