水牛卵母细胞冷冻保存初步研究

邵庆勇，杨红远，牛自兵，李卫娟，朱 兰，吕春荣，洪琼花

（1.云南省畜牧兽医科学院，昆明 650224；2.云南省芒市畜牧兽医局）

卵母细胞的有效冷冻保存不仅可以储备哺乳动物遗传资源，而且在家畜胚胎移植产业化技术体系中起着重要作用，动物卵母细胞是母系遗传信息的载体，卵母细胞的长期冷冻保存，在品种资源保护和改良、资源共享与交换、濒危动物的挽救、核移植、转基因动物研制等方面都具有独特的优势和应用价值。卵母细胞的冷冻保存，对探讨其低温生物学特性和体外受精机理的研究有重要意义。牛卵母细胞的冷冻保存，国外开展了不少研究，并获得了可喜的进展，Vajta等于1998年获得了来自冷冻牛体外成熟卵母细胞的牛犊［1］，到2002年，Vieira等又获得了来自冷冻未成熟牛卵母细胞的牛犊［2］。但水牛方面的研究较少，国内开展水牛卵母细胞冷冻保存的报道也较少，仅见西南大学和广西大学研究人员开展了部分研究，整体上还停留在初步探索的阶段［3-9］。本试验在借鉴牛羊胚胎冷冻的基础上开展水牛MⅡ期卵母细胞的玻璃化冷冻保存和水牛G V期卵母细胞常规冷冻保存，以比较不同冷冻保护剂组成及冷冻载体对MⅡ期卵母细胞玻璃化冷冻保存解冻后的发育影响，同时探索不同预处理时间和平衡时间对水牛G V期卵母细胞常规冷冻保存的影响。

1 材料与方法

1.1 试验用各种液体的配制

1）抽卵液：TCM-199（GIBCO）。

2）体外成熟液：TCM-199+15 μg/mL FSH（ICP）+15 μg/mL LH（Bioniche）+1 μg/mL E2（Sigma）+100 μmol/L半胱胺（Sigma）+10%FBS（Hyclone）。

3）mSOF 液：NaCl 0.629 4 g，KCl 0.053 4 g，KH2PO40.016 2 g，NaHCO30.210 6 g，乳酸钠 0.037 0 g，丙酮酸钠0.003 6 g，青霉素 0.006 5 g，链霉素 0.005 0 g，CaCl2·2H2O 0.0072g，MgCl2·6H2O0.0348g，超纯水溶解定容到100mL，调 pH 至 7.2～7.4，0.2 μm 滤膜过滤器过滤灭菌，4℃保存。

4） 培养液（mSOFaa液）：mSOF+1%NEAA+2%EAA+0.3%BSA。

5）玻璃化冷冻预处理液、玻璃化溶液和解冻液的配制：30%（w/v）聚蔗糖添加0.5 mol/L蔗糖，经mPBS溶解后制成FS溶液。

预处理液和冷冻液的配制见表1。

表1 各种预处理液和冷冻液组成（v/v）%

1.2 OPS管和GMP管的制备 自制的小酒精灯上，明火将0.25mL（France）塑料细管加热，待变软后拉制成OPS（open pulled straw）管。在空气中冷却后用手术刀片在其细端切开。OPS管的管壁外径为0.20 mm±0.01 mm，管壁厚约0.02 mm，细端长度为2.5cm±0.5cm。将直径为2.58 mm、长度为10cm的玻璃细管（北京正天易科贸有限责任公司生产）于中部在酒精灯火焰上加热、拉细，然后用小砂轮片轻划，断开，制成2根GMP（glass micropipette）管。在体视显微镜下检查端口大小是否平齐，内径较卵母细胞直径稍大一点，并用酒精灯火焰对有刺部位进行短时烧熔。

1.3 卵母细胞的采集与成熟培养 将从屠宰场采集的水牛卵巢放入含青、链霉素各5万u/L的30～35℃生理盐水保温瓶中，4 h内运回实验室。在实验室内用含双抗的38℃生理盐水冲洗2遍后，先在带有18G针头的10mL一次性注射器内抽取5mL 38℃抽卵液，然后抽吸卵巢表面2～6 mm直径的卵泡，每抽完4～6个卵巢后，把液体注入15mL离心管于38℃静置沉淀。最后把离心管下1/2液体置于直径为90 mm的一次性培养皿中，在保温板温度为38℃的体视镜下捡卵，定级。

从卵巢上直径大于2 mm的卵泡中获得卵母细胞，外面有多层卵丘细胞包围，称卵丘-卵母细胞复合体（cumulus-oocyte complexes，COCs），根据形态特征将 COCs分为4个级别，A级为卵胞质致密均匀，至少有4层以上卵丘细胞完全包裹卵母细胞，呈黑色至深灰色，实体显微镜下光线不能透过；B级为卵胞质致密，有2～4层卵丘细胞完全包裹卵母细胞，胞质深灰色，实体显微镜下观察光线微能透过；C级为半裸卵，卵母细胞周围2/3被一层卵丘细胞包裹；D级为裸卵，无卵丘细胞包被。A、B级卵母细胞用于开展本试验。

将准备培养的COCs在抽卵液中洗涤3次后，用成熟液洗涤3次。然后置于预平衡2 h以上、上覆矿物油的100 μL 成熟培养滴中，10～15 枚 COCs/滴；于 38.5 ℃、5%CO2的空气、100%湿度的培养箱中培养24 h。

1.4 卵母细胞冷冻和解冻

1.4.1 卵母细胞的毒性试验 体外成熟24 h的卵母细胞采用移液枪吹打法脱去扩散卵丘细胞，在体视显微镜下观察极体，把排出极体的正常卵子先分别置于10%EG、10%EG+10%DMSO的预处理液中平衡30 s，再分别置于冷冻保护剂 EFS30、EFS40、EDFS30、EDFS40 中处理25 s后，先于0.25 mol/L蔗糖液中脱洗1 min，再移入0.15 mol/L的蔗糖解冻液中平衡5 min以脱去保护剂，用成熟液洗涤3次后移入培养液中培养30 min后进行孤雌激活以观察成熟卵母细胞的发育率。对照组为直接进行孤雌激活，未经过毒性试验。

1.4.2 MⅡ期卵母细胞的OPS或GMP法冷冻解冻 将室温调至25℃，使试验用具及试剂得到充分平衡，试验在37～38℃恒温台上操作。首先将体外成熟24 h的卵母细胞采用移液枪吹打法脱去扩散卵丘细胞，在体视显微镜下观察极体，用口吸管连接的OPS/GMP管把排出极体的正常卵子移入10%EG、10%EG+10%DMSO中平衡30s，然后移入玻璃化液（EFS30、EFS40、EDFS30、EDFS40）中平衡25 s，最后将卵子吸入OPS/GMP管中直接投入液氮冷冻保存。每支管装入8～10枚卵母细胞。

解冻时，OPS/GMP管从液氮中取出后，立即将含有卵母细胞部分直接浸入置于恒温台上的含有0.25 mol/L蔗糖解冻液的培养皿中，溶解后将卵母细胞从OPS/GMP管中吹出并摇动混匀，在此液中平衡1 min，然后移入0.15 mol/L蔗糖解冻液中平衡5 min，再用成熟培养液洗涤3次后移入培养液中培养30 min后进行孤雌激活。

1.4.3 G V期卵细胞的常规冷冻保存及解冻 在借鉴牛羊胚胎常规冷冻保存方法基础上，采用程序降温仪冷冻保存水牛G V期卵母细胞，G V期卵母细胞先分别在0.5 mol/L和1.0 mol/L EG中平衡5 min或8 min后，将卵母细胞移入事先装有1.5 mol/L EG的0.25mL塑料细管中平衡15 min或18 min，然后将细管装入冷冻仪，以-3℃/min的速率降温至-6.5℃植冰，植冰后保持10 min，再以-0.3℃/min的速率降至-35℃，保持10 min后投入液氮中保存。卵母细胞解冻是在25℃室温下，将细管从液氮中取出，在空气浴和30℃水浴中分别晃动10 s，取出细管，剪掉两端，用内含0.5 mol/L蔗糖液的注射器将内容物冲洗到培养皿中，在显微镜下回收卵母细胞，然后将卵母细胞移入新鲜的0.5 mol/L、0.3 mol/L蔗糖液中分别平衡5.0 min，最后用成熟液洗卵，移入新鲜成熟液中进行体外成熟培养。

1.5 卵母细胞的激活 毒性试验和冷冻解冻后的MⅡ期卵母细胞用含 5 μmol/L Ionomycin（Sigma）的培养液激活处理5 min，经培养液洗涤3次后再置于含2 mmol/L 6-DMAP（Sigma）的培养液中培养4 h，最后移入mSOFaa液中进行体外培养。

1.6 卵母细胞存活率和发育能力的鉴定 卵母细胞冻后形态恢复率的鉴定主要依据其冻后细胞膜和透明带的完整性及胞质和卵丘细胞是否均匀加以判断，以成熟率和孤雌激活后卵裂率作为评定卵母细胞发育能力的指标。

1.7 统计分析 采用SPSS中的ANOVA分析，数据在分析前进行反正弦转化，各处理平均值的比较采用邓肯检验。

2 结果

表2 水牛MⅡ期卵母细胞毒性试验结果

2.1 不同玻璃化冷冻保护剂组成对MⅡ期水牛卵母细胞毒性试验 分别用EFS30、EFS40、EDFS30、EDFS40玻璃化冷冻液对MⅡ期水牛卵母细胞进行毒性试验。试验组卵母细胞形态正常率与对照组均无显著性差异（P＞0.05），4种冷冻液处理组间形态正常率亦无显著性差异（P＞0.05）；EFS30、EFS40、EDFS30、EDFS40 处理组卵母细胞孤雌激活卵裂率分别为（68.44±3.14）%、（64.53±4.88）%、（50.54±4.18）%、（46.06±3.43）%，EFS30、EFS40 组与对照组（75.28±4.70）%无显著性差异（P＞0.05），EDFS30、EDFS40组与对照组和EFS30、EFS40组间差异显著（P＜0.05）（详见表2），说明含DMSO冷冻液毒性较大。

2.2 水牛MⅡ期卵母细胞OPS法冷冻保存研究 分别以 EFS30、EFS40、EDFS30、EDFS40 作为冷冻液，采用OPS法冷冻保存MⅡ期水牛卵母细胞。结果表明：EDFS30、EDFS40组卵母细胞解冻后形态正常率显著高于 EFS30、EFS40 组 （P＜0.05），EDFS30 与 EDFS40 间、EFS30与EFS40间形态正常率均无显著性差异（P＞0.05）；EDFS40、EDFS30、EFS40 组卵母细胞解冻后孤雌激活卵裂率分别为（31.60±4.13）%、（28.49±3.69）%、（23.08±3.36）%，均显著高于 EFS30组的（19.05±3.93）%（P＜0.05）。其中以EDFS40作为冷冻液，卵母细胞冷冻解冻后孤雌激活卵裂率最高（详见表3）。

表3 不同冷冻液OPS法冷冻保存水牛MⅡ期卵母细胞效果比较

2.3 不同载体玻璃化冷冻MⅡ期水牛卵母细胞效果 以EDFS 40作为冷冻液，采用GMP法冷冻MⅡ期水牛卵母细胞，解冻后形态正常率和卵裂率分别为（94.55±1.93）%、（45.63±2.56）%。与 OPS 法相比，解冻后卵母细胞形态正常率无显著差异，但GMP法卵裂率较OPS法高 14.03个百分点（P＜0.05，详见表 4）。

表4 OPS、GMP法冷冻保存水牛MⅡ期卵母细胞效果比较

2.4 水牛G V期卵母细胞常规冷冻保存研究 试验设计了不同预处理时间和平衡时间的细管常规冷冻，结果显示各冷冻组的形态正常率和极体排出率与对照组相比差异极显著（P＜0.01），预处理 5 min、8 min 和平衡15 min、18 min各组间解冻后卵母细胞形态正常率和极体排出率均无显著性差异（P＞0.05），但以预处理5 min、平衡15 min组的形态正常率和极体排出率相对较高，分别为 72.73%、27.27%（详见表5）。

表5 不同预处理时间和平衡时间常规冷冻水牛G V期卵母细胞结果比较

3 讨论

3.1 本研究首先开展不同冷冻液组成对MⅡ期水牛卵母细胞毒性试验，结果表明含DMSO冷冻液毒性较大。但分别以 EFS30、EFS40、EDFS30、EDFS40 作为冷冻液、采用OPS法冷冻保存MⅡ期水牛卵母细胞，结果表明以EDFS40作为冷冻液，卵母细胞冷冻解冻后孤雌激活卵裂率最高，达（31.60±4.13）%。玻璃化冷冻液中所采用的渗透性抗冻保护剂主要有丙三醇（glycerol）、二甲基亚砜（DMSO）、丙二醇（PROH）、乙二醇（EG）和乙酰胺（acetamide）、丁二醇（butadiene）等，这些化学物质对卵母细胞具有化学毒性，冷冻液渗透到细胞内，一方面可通过抑止细胞内冰晶的形成来保护细胞免受机械损伤，另一方面细胞长时间暴露于高浓度抗冻保护剂时容易受到化学损伤。EG分子量较小，对细胞膜的通透性较强，化学毒性较小，玻璃化状态形成稍差，常用于慢速程序冷冻中；DMSO分子量较大，通透性较EG差，化学毒性较大，对细胞骨架的损伤特别明显，但玻璃化状态形成好，DMSO对卵细胞的毒性决定于暴露过程中的持续时间和温度，表现为较低温度下应用DMSO具有较好结果［10］。结合2种抗冻剂的冷冻液既提高了抗冻剂的渗透性，又可缓解DMSO的化学毒性，形成良好的玻璃化状态，因此采用EG加DMSO作为冷冻保护剂主要成分的EDFS 40效果较好。抗冻保护剂对胚胎毒性从小到大顺序为：EG＜甲醇＜DMSO＜甘油＜丙二醇＜丁二醇［11］。可见，选择适当的冷冻保护剂至关重要，目前寻找容易实现玻璃化并具有低或无细胞毒性的冷冻保护剂是进一步提高玻璃化冷冻效率的关键。

3.2 本试验以EDFS40作为冷冻液，采用GMP法冷冻MⅡ期水牛卵母细胞，解冻后形态正常率无显著差异，但GMP法卵裂率高于OPS法，这可能跟玻璃细管和塑料OPS细管的导热性能有关。细管的冷冻降温速度最高只能达到2 000℃/min，开放式拉长细管（OPS）由0.25mL细管加热变软后拉制而成，因管壁较细管薄，冷冻和解冻速度高达20 000℃/min，是细管法的10倍［12］，GMP管由玻璃细管拉制而成，管壁更薄，导热性更强，降温和解冻速率比OPS更高，投入液氮后不象OPS管那样容易炸裂，玻璃比塑料密度大，在液氮中不像OPS管那样浮起，玻璃细管可自行拉制，内径范围远比OPS管宽，由于GMP玻璃化冷冻卵母细胞和胚胎的原理和操作与OPS法相似，加之上述优点，GMP法显得更便利，有望在卵母细胞和胚胎冷冻中得到广泛应用［3］。

3.3 本试验参照胚胎常规冷冻保存设计了不同预处理时间和平衡时间G V期卵母细胞的细管法常规冷冻，结果显示各冷冻组的形态正常率和极体排出率与对照组相比差异极显著（P＜0.01），预处理5 min，平衡 15 min组的形态正常率和极体排出率相对较高，分别为72.73%、27.27%。据报道，由于卵母细胞和早期胚胎的发育阶段不同，在超微结构上存在很大的差异，因此用胚胎的冷冻方法可能不完全适合于卵母细胞的冷冻保存。相对于慢速冷冻保存来讲，玻璃化快速冷冻保存应用了更高浓度的保护剂（最高可达7M）并大大增加了冷冻保存的速度，在此情况下，细胞迅速脱水，在不产生冰晶的情况下，冷冻液的粘度增大从而引起冷冻液呈玻璃状。因此，玻璃化冷冻方法产生后，研究者更倾向于利用该方法研究卵母细胞的冷冻［12］，我们将在以后的工作中进一步开展水牛G V期卵母细胞常规冷冻和玻璃化冷冻比较。

3.4 发育阶段不同，对冷冻和卵母细胞的使用存在影响。Fuku等［13］研究表明牛G V期卵母细胞要比成熟的卵母细胞更敏感于抗冻保护剂，国内也有学者认为成熟卵母细胞玻璃化冷冻效果显著优于G V期［14］。Im等［15］研究了成熟阶段对冷冻效果的影响，在体外成熟培养0、6、12、18、24 h的牛卵母细胞常规程序冷冻，解冻后再进行培养达到24 h，结果表明，未成熟卵母细胞比成熟卵母细胞对冷冻的耐受性低。M II期卵母细胞优越性在于卵母细胞已处于成熟期，解冻后可直接用于体外受精，无需再进行体外成熟培养，其不足在于具有对温度敏感性非常高的纺锤体，在降温过程中极易解聚，使出现非整倍染色体的几率增加，影响卵母细胞的发育。冷冻保存G V期卵母细胞因为染色体有核膜包裹则可避免损伤，但主要问题不是核而是胞质的改变，G V期卵母细胞冷冻后超微结构（微绒毛、线粒体、内质网等）损伤严重，解冻后又受到成熟效果的影响而大大降低利用率。另外，G V期卵母细胞解冻常见的结果是卵丘细胞脱落，破坏了未成熟卵母细胞卵丘细胞及颗粒细胞之间代谢底物的摄取途径（胞间连接），而成熟卵母细胞和周围的卵丘细胞不再耦联，卵丘细胞的突起自卵母细胞表面收回，这可能也是成熟卵母细胞较GV期卵母细胞耐冻的原因之一。

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