山羊Ets-1基因cDNA的克隆与序列分析

李 君，罗 军，许会芬，胡仕良

（西北农林科技大学动物科技学院 陕西省农业分子生物学重点实验室，陕西 杨凌 712100）

转录调控因子（E26 transformation-specific，Ets）通过调节细胞的增生［1］、分化、凋亡及细胞与细胞间的相互作用，在许多生理和病理过程中发挥重要作用［2］。Ets转录因子受多种信号通路的调控，如MAP激酶（ERK，p38和 JAK）［3］、Ca2+依赖的信号通路、TGF-β 和 JAK/STAT 信号通路等［4］。研究发现，众多参与细胞外基质降解的蛋白酶类、细胞因子的启动子序列中都含有Ets-1的结合位点［5］。山羊泌乳过程中脂肪酸代谢受到众多基因的调节，这些基因的表达调控常常受到多种信号通路以及细胞因子的调控。研究表明，Ets-1基因能通过调控一些细胞因子影响细胞脂肪酸代谢。本研究旨在克隆西农萨能羊Ets-1基因的cDNA，为进一步研究该基因在山羊泌乳过程中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 采集处于泌乳末期的西农萨能羊乳腺组织2 g左右，用DEPC灭菌水洗净样品表面残留的血液及杂质，迅速投入液氮中保存备用。

1.1.2 主要试剂 DEPC购自美国Sigma公司；Trizol和5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Version 2.0购自美国Invitrogen公司；3’-Full RACE Core Set Version 2.0、LA Taq DNA 聚合酶、10×LA Buffer II、dNTPs及pMD19-T载体等购自大连宝生物工程有限公司（TaKaRa）；DNA片段快速回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；TOP10感受态细胞、DNA Marker DL2000、MarkerⅢ及普通质粒提取试剂盒等均购自北京天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 通过对GenBank中牛（NM_001099106）、人（NM_005238）和小鼠（NM_011808）等物种的 Ets-1基因进行同源性比对（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/），找出该基因在不同物种间的保守区域，利用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0软件设计特异性克隆引物（表1），包括：RT-PCR 引物 ES1和 EA1，5’RACE 引物 EGSP、E51、E52，3’RACE 引物 E31和 E32。

表1 山羊Ets-1基因cDNA克隆引物

1.2.2 RNA提取与cDNA合成 采用Trizol法提取总RNA，加入DNaseⅠ去除可能存在的基因组DNA，将所提取的总RNA进行分装，一部分于-80℃保存备用，另一部分用于紫外分光光度仪测定和琼脂糖凝胶电泳检测。按照TaKaRa公司PrimeScriptRT reagent Kit说明将检测合格的RNA反转录成cDNA，-20℃保存备用。

1.2.3 Ets-1基因cDNA的克隆与测序 以西农萨能羊泌乳末期的乳腺组织cDNA为模板，进行CDS区的PCR扩增。其反应体系为：2 μL 10×LA Buffer II（含 Mg2+），2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），1 μL ES1（10 μmol/L），1 μL EA1（10 μmol/L），0.2 μL LA Taq DNA 聚合酶 （5 u/μL），50～100 ng模板，加ddH2O至20 μL。PCR反应条件：95℃预变性 4 min；94℃变性 30 s，63℃退火 30 s，72℃延伸 1 min 20 s，32个循环；72℃延伸 10 min，4℃保温。取 5 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

根据 Invitrogen 的 5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends操作说明进行5’UTR的扩增，选用EGSP、E51 和 E52；根据 TaKaRa的 3’-Full RACE Core Set操作说明进行3’UTR的扩增，选用引物E31和E32。方法见各自操作说明，退火温度见表1。

将所有扩增产物于1%琼脂糖凝胶中进行电泳，用DNA快速回收试剂盒回收目的片段，与pMD19-T载体于16℃连接过夜；次日将连接产物转化TOP 10感受态细胞，复苏后涂布于含有 24 μg/mL X-gal，20 μg/mL IPTG及100 μg/mL Amp的LB培养皿表面，37℃培养12～16 h；挑取单个白色阳性菌落进行质粒提取和酶切鉴定，将含阳性重组质粒的菌液送于Invitrogen上海英骏生物技术有限公司测序。

1.2.4 序列分析 利用NCBI中的blastn和blastp（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）对测序得到的Ets-1基因序列进行同源性分析；通过BioXM 2.6软件对Ets-1的氨基酸序列进行物种间多序列比对；利用ExPASy网站的ProtScale程序对氨基酸序列作疏水性分析（http：//us.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）和Protparam对蛋白质的分子量及等电点进行预测（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）；通过CBS Prediction Servers中的 TMH MM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/） 和 CPHmodels（http：//www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/）分别对 Ets-1的跨膜结构、信号肽区域和二级结构进行预测。

2 结果与分析

2.1 山羊Ets-1基因cDNA的克隆 以山羊乳腺总RNA为模板，通过RT-PCR和RACE技术克隆得到山羊Ets-1基因cDNA全长2 263 bp（GenBank收录号为HQ589338）。经序列分析表明：山羊Ets-1基因的CDS区全长1 326 bp（图1A），编码441个氨基酸残基，其起始密码子为ATG，终止密码子为TGA；Ets-1基因的5’UTR为 331 bp（图 1B）；3’UTR 为 606 bp（图 1C），包括完整的poly（A）尾巴。

图1 Ets-1基因克隆产物琼脂糖凝胶电泳

2.2 山羊Ets-1的同源性分析 经序列比对发现，山羊Ets-1基因与其他物种相似性较高，其ORF与GenBank中牛（NM_001099106）、猪（NM_001162886）、人（NM_005238）和小鼠（NM_011808）的Ets-1基因相比较，核苷酸相似性分别为98%、94%、92%和90%，氨基酸的相似性分别为98%、98%、98%和96%（图2）。其非翻译区核苷酸与牛、猪、人和小鼠的相应序列相比较，5＇UTR相似性分别为98%、85%、82%和 71%，3＇UTR 与牛、猪、人和小鼠相似性分别为96%、83%、81%和77%。

图2 山羊、牛、人、小鼠、猪Ets-1基因氨基酸序列比对结果

2.3 山羊Ets-1的结构分析 经SignalP预测分析，山羊Ets-1不存在信号肽序列（图略）；经TMHMM跨膜结构预测发现，该序列不存在跨膜结构，属于膜外蛋白（图略）；蛋白质疏水性预测分析（图3）表明，Ets-1的N-端和C-端均存在明显的亲水性区域（Score＞1.5），其中376—384AA残基具有较强的亲水性（Score＞2）；蛋白质的分子量及等电点预测发现，Ets-1的蛋白质分子量为50 340.8D，理论等电点为5.08。

利用CPH models 2.0软件预测得到山羊Ets-1的蛋白结构，结果发现Ets-1具有典型的螺旋-转角-螺旋结构，含有3个α-螺旋和4个β-折叠以H1-S1-S2-H2-H3-S3-S4方式排列。

图3 山羊Ets-1的疏水结构预测

3 讨论

Ets家族是最大的信号依赖转录调控因子家族之一，在细胞、组织和器官水平，Ets家族转录因子参与多种哺乳动物的生长发育过程，包括细胞增殖、分化、迁移、凋亡和细胞间相互作用。本研究首次克隆了西农萨能羊Ets-1基因的cDNA序列，其全长2 263 bp，编码441个氨基酸。该基因的CDS区与其他哺乳动物间存在高度同源性，与牛、小鼠、大鼠、猪和人的Ets-1基因相比，其核苷酸相似性在90%以上，氨基酸相似性在95%以上。山羊与牛5＇UTR的相似性为98%，3＇UTR的相似性为96%，该基因与其它物种非翻译区（5＇UTR 和 3＇UTR）的相似性不高，并且存在较大差异。由于非翻译区对基因转录和翻译水平的调控起到非常重要的作用，大多数调控序列也都集中于非翻译区。本实验对山羊Ets-1基因的非翻译区进行了克隆，为研究该基因的调控机制提供参考。

细胞对外界刺激的反应由一系列信号级联转导所控制，它们将细胞外受体接受的信号传递到细胞核［6］。Ets家族转录因子就属于信号转导通路中的细胞核效应物，接受信号后控制基因的转录［7］。Ets家族既可以作为信号转导的上游效应物，表达为多种生长因子的受体；也可以作为信号转导的下游效应物，其活性直接受磷酸化作用的控制，确定它们是激活还是抑制相应的靶基因［8］。近年来的研究表明，Ets家族转录因子的失调与肿瘤的发生发展有密切关系，Ets家族蛋白（如Ets-l和Ets-2）的过度表达，可以诱导体外培养细胞恶性变异，也可以诱导实验动物发生肿瘤［9-10］。在许多类型的人类肿瘤中都已发现Ets-1的过度表达［11］，且在乳腺癌、肺癌和肠癌中Ets-1的表达水平已成为评价肿瘤恶性度和预后的重要指标。

目前关于Ets-1在肿瘤方面的研究广泛，在其它方面研究甚少。但对关于激活Ets-1表达的信号通路、受Ets-1调控的靶基因了解不够充分。因此，本实验对羊乳腺Ets-1基因进行克隆与分析，为转录因子Ets-1在山羊上的功能及调控机理研究奠定基础。

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