高效液相色谱法同时测定金银花中绿原酸和木犀草苷的含量*

张元元，李 进，陈 涛，李凤丽

金银花为忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或带初开的花[1]。又名银花、金花、忍冬花、金藤花等。其味甘,性寒,具有清热解毒、疏散风热之功效,临床常用于治疗肺炎、急性痢疾、婴幼儿腹泻、宫颈糜烂、眼科炎症等。金银花中含挥发油、黄酮类、三萜类、有机酸、苷类、微量元素等成分，其主要活性成分是绿原酸以及以木犀草苷为代表的黄酮类成分[2]。目前常规的检测方法是分别采用高效液相色谱（HPLC）法测定绿原酸和木犀草苷的含量，增加了检测工作量,且色谱峰不易分开，峰形、分离度也不理想。本实验建立了HPLC法同时检测金银花中两种成分的含量，在此色谱条件下两种成分分离完全，该方法简便，准确，快速易行，可为金银花的质量控制提供一定的参考[3]。

1 仪器和试药

1.1 仪器 仪器：美国Waters高效液相色谱仪，Waters600E泵，2998二级管阵列检测器（DAD），Waters Empower工作站；超声波清洗器TCQ250（北京医疗设备二厂）；电子分析天平JA2003（上海精科天平厂）等。

1.2 试药 绿原酸对照品（110753-200413），木犀草苷对照品（111720-200905），由中国药品生物制品检定所提供；乙腈为色谱纯；水为重蒸水,自制；其他试剂均为分析纯。

金银花为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾及初开的花，山东平邑县产（10060）。

2 条件与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Xterra@PR185（46nm×250nm，5 μm）；Waters In-Line 脱气机；流动相：乙腈-0.5%冰乙酸，二元梯度洗脱，0～15 min，乙腈10%～20%，15～30 min，乙腈 20%～25%，30～40 min，乙腈 25%～35%,40～45 min，乙腈 35%～10%；流速 1.0 mL/min；检测波长 350 nm；柱温：室温；进样量：10 μL；理论塔板数按绿原酸计算应不低于1 000，理论塔板数按木犀草苷计算应不低于20 000。

2.2 混合对照品溶液的制备 精密称定对照品绿原酸、木犀草苷适量，加70%甲醇制成1 mL含绿原酸36.4μg，含木犀草苷44.4μg的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 精密称取金银花细粉（过4号筛）约2 g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，称定质量，超声处理（功率250 W，频率35 kHz）1 h，放冷，再称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10 mL，回收溶剂至干，残渣用70%乙醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，即得。

按以上色谱条件得到对照品、金银花色谱图。见图 1、图 2。

图1 对照品色谱图

图2 金银花样品色谱图

2.4 线性关系考察 精密称取绿原酸、木犀草苷对照品，加70%甲醇制成1mL含绿原酸3.52mg和1 mL含木犀草苷0.19mg的溶液，作为储备液,再分别精密量取 5、10、15、20 mL，置 25 mL 量瓶中，加 70%甲醇稀释至刻度，分别精密吸取上述4种浓度的对照品溶液与储备液各10 μL，注入液相色谱仪，按“2.1”色谱条件分析，测定各自峰面积（RSD），以对照品浓度（μg/μL）为横坐标，峰面积值为纵坐标，求得回归方程：绿原酸：Y=41 019.10X+45 849.75，r=0.999 9；木犀草苷：Y=2 537.98X+269.08，r=0.999 5。结果表明线性良好。

2.5 精密度实验 精密吸取上述混合对照品溶液，连续进样6次，10 μL/次，测定峰面积绿原酸和木犀草苷峰面积的RSD值分别为1.0%和1.1%。表明仪器精密度良好。

2.6 重复性实验 取同一批金银花样品（山东产）2 g按“2.3”项下方法提取，按“2.1”项下方法测定含量，连续进样6次，测定样品中绿原酸、木犀草苷的峰面积，测得峰面积值的RSD分别为为1.90%和2.3%，符合要求。

2.7 重现性实验 取同一批金银花样品（山东产）2 g按“2.3”项下方法提取，按“2.1”项下方法测定含量。平行操作6份,计算绿原酸、木犀草苷平均含量分别为 1.840%（RSD＝2.0%）、0.095%（RSD＝2.32%）符合要求。

2.8 稳定性实验 取“2.3供试品溶液”项下，按“2.1 色谱条件”项下于配置 0、1、2、4、6、12 h 分别进样10 μL，进行含量测定，结果绿原酸和木犀草苷峰面积的RSD为1.90%和1.41%，结果表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.9 加样回收率实验 精密称取6份已重复测定的金银花药材粉末1 g，分别精密加入一定量的对照品，按“2.3”项下方法制备供试品液，按“2.1”项下方法测定含量，计算回收率。结果见表1-2。

表1 绿原酸的加样回收率实验测定结果

表2 木犀草苷的加样回收率实验测定结果

2.8 样品含量测定 按“2.1”项下色谱条件,测定金银花药材中2种成分的含量，结果见表3。

表3 样品含量测定结果%

3 讨论

由于绿原酸与木犀草苷极性相差较大,而且样品中两者的含量差别很大，故等度洗脱不能将两者分离。经过考察最终确定0.5%冰乙酸-乙腈作为流动相,再进行梯度洗脱条件的优化,所得图谱基线平稳,绿原酸与木犀草苷均达到较好的分离。

2010版药典规定通过测定绿原酸和木犀草苷的含量来综合评价金银花的质量。本实验建立了HPLC法同时检测金银花中两种成分的含量，在此色谱条件下两种成分分离完全，该方法简便，准确，快速易行，可为金银花的质量控制提供一定的参考。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典·一部[S].北京:中国医药科学技术出版社,2010:205.

[2]王发国，叶华谷，马其侠，等.金银花及其药理作用[J].生物学通报，2004，39（5）：17－18.

[3]张丽玲，郭 伟.HPLC法测定脑血栓丸（I号）中芍药苷的含量[J].天津中医药大学学报，2009，28（2）：86-87.