响应面设计优化超临界CO2抗溶剂法制备负载β-胡萝卜素的玉米蛋白纳米粒

孙丽君，林长春，赵翔宇，赵亚平,*

(1.上海交通大学化学化工学院，上海 200240；2.江南大学化学与材料工程学院，江苏 无锡 214122)

响应面设计优化超临界CO2抗溶剂法制备负载β-胡萝卜素的玉米蛋白纳米粒

孙丽君1，林长春1，赵翔宇2，赵亚平1,*

(1.上海交通大学化学化工学院，上海 200240；2.江南大学化学与材料工程学院，江苏 无锡 214122)

利用响应面设计对超临界CO2抗溶剂法制备负载β-胡萝卜素的玉米蛋白纳米粒的工艺进行研究。分别以β-胡萝卜素的负载量和包埋率为优化指标，系统考察芯材比、温度、压力等主要因素对玉米蛋白包埋β-胡萝卜素的交互影响，采用SEM、DLS和XRD对产品形貌、粒径和结构等进行表征。结果表明：芯材比对载药量和包埋率的影响最显著，其次是压力，最后是温度。当芯材比1:10(质量比)、温度55℃、压力8MPa时，β-胡萝卜素的负载量达到最大值8.73%；当芯材比1:30、温度35℃、压力16MPa时，β-胡萝卜素的包埋率有最高值85.4%。玉米蛋白和β-胡萝卜素形成Matrix结构，颗粒平均粒径大约150nm，粒径分布窄，球形度好。

超临界二氧化碳；β-胡萝卜素；玉米蛋白；响应面法

β-胡萝卜素是一种广泛存在于植物和果实中的脂溶性营养成分[1]，具有多种生理功能，它的抗氧化活性可以保护机体组织免受氧自由基的毒害，具有预防癌症、预防心血管疾病、抗辐射、提高机体免疫力等保健功能[2]。由于β-胡萝卜素不溶于水，对光、空气敏感，极易氧化而降低其生物活性，在实际应用中受到限制[3]。为此，人们直接将β-胡萝卜素微粉化以提高在水中的分散性，或者与生物相容性聚合物混合制成微粒，以提高β-胡萝卜素的生物利用度和稳定性，其中气流粉碎、喷雾干燥、重结晶(溶剂蒸发或液体抗溶剂)是常用方法。但是，这些技术存在很多缺点，或者易导致β-胡萝卜素分解，有机溶剂污染，或者产品粒子粒径很大，分布尺度很宽。与传统微粉化技术相比，以CO2为抗溶剂的超临界流体抗溶剂技术(supercritical fluid anti-solvent，SAS)，特别适合微粉化热敏感、易氧化的物质，该技术具有反应条件温和、工艺简单、产品粒径小、尺度可控、低溶剂残留等优点[4-6]。

玉米蛋白是从玉米中提取出来的醇溶性谷蛋白，是生物相容性和生物可降解性良好的药物载体材料。玉米蛋白作为载体材料，已包埋过伊维菌素[7-8]、胰岛素[9-10]、环丙沙星[11]、溶菌酶[12-13]等药品，表现出良好的缓释性能，抗胃蛋白酶分解性，是良好的肠溶性包衣材料。

本实验以β-胡萝卜素为模型药物，玉米蛋白为包埋材料，采用超临界二氧化碳抗溶剂技术制备负载β-胡萝卜素的玉米蛋白纳米粒。考察芯材比、温度、压力、溶液流速等多因素对负载β-胡萝卜素的玉米蛋白纳米粒的形成，载药量和包埋率的影响。本实验采用响应面法[14-15]对各主要因素及交互作用进行系统研究，以获得最佳制备条件。分别采用扫描电镜(scanning electron microscope，SEM)、粒度分析仪(dynamic light scattering，DLS)、X射线衍射(X-ray diffractomer，XRD)对产品形貌，粒径大小结构等进行了表征。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米蛋白(食品级) 上海基星生物科技有限公司；β-胡萝卜素(纯度≥97.5%) 北京伊普瑞斯科技有限公司；乙醇、二氯甲烷(分析纯) 国药集团化学试剂有限公司；二氧化碳(工业级，含量≥99.5%) 上海瑞利化工气体有限公司。

1.2 仪器与设备

FA2004型电子分析天平 上海天平仪器厂；SP-756型紫外-可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；800B型超声仪 上海安亭科学仪器厂；HJ-4A型搅拌器金坛市杰瑞尔电器有限公司；AXS型X射线粉末衍射仪德国Bruker公司；JSM-7401型扫描电子显微镜 日本电子株式会社；SFE121-50-01型超临界萃取装置 南通华兴石油仪器有限公司；ZS-90型纳米粒度仪 英国马尔文仪器公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

图1 SAS过程设备流程图Fig.1 Schematic digram of SAS appatus

实验过程，先设定热交换器4和空气浴5的温度，到预定温度后，用高压柱塞泵3将CO2泵入到沉淀釜。待压力达到设定值，保持CO2的泵入速率，打开放气阀，建立动态平衡体系，保持釜内压力恒定。高效液相泵7以恒定速率将溶液打入沉淀釜6，溶液与CO2经同轴喷嘴进入釜腔，溶剂扩散并溶解于超临界CO2中，同时CO2扩散进入溶剂中使溶剂膨胀，原溶液中的β-胡萝卜素和玉米蛋白达到过饱和沉析出来，并收集于釜底过滤板上。打完溶液后，停止高效液相泵7，继续用高压柱塞泵3泵入CO230min，以去除残留的有机溶剂。最后，停止高压柱塞泵，缓慢泄压至釜内压力降为大气压，打开釜腔，收集分析过滤板上的样品。

1.3.2 β-胡萝卜素负载量的测试

利用紫外-分光光度法测试并计算β-胡萝卜素质量。具体步骤如下：称取5.0mg样品，置于25.0mL容量瓶中，二氯甲烷乙醇混合溶剂(体积比9:5)超声溶解，使负载的β-胡萝卜素充分溶解，利用SP-752PC型紫外-可见分光光度计测试。并计算β-胡萝卜素负载量。

1.3.3 β-胡萝卜素包埋率的测试

β-胡萝卜素在样品中有两种存在方式，包埋在纳米粒中，或附着在纳米粒表面。正己烷能溶解一定量的β-胡萝卜素，而不溶解玉米蛋白，因此用正己烷清洗附着在纳米粒表面的β-胡萝卜素，以计算包埋率。具体步骤如下：称取5.0mg样品于5mL离心管中，加入正己烷，剧烈震荡后，在10000r/min的转速下离心，取上清液至25.0mL容量瓶中定容，用紫外分光光度计测试。β-胡萝卜素的包埋率计算公式如下：

β-胡萝卜素包埋率/%=

1.3.4 SEM分析

将少许样品颗粒粘在导电胶上，真空状态下喷金4min，喷金厚度约为250A，然后采用SEM对样品进行观察分析。

1.3.5 DLS分析

称取样品5.0mg，用20mL去离子水分散，超声1min，用纳米粒度仪测定粒径大小。

1.3.6 XRD分析

通过X射线粉末衍射仪，考察样品处理后结晶度的变化。采用Cu靶(Cu-Kα)，石墨单色滤波器，连续扫描，电压40kV，电流30.0mA，2θ：5～60°，速度10°/min。

2 结果与分析

2.1 响应面试验结果

称取一定量的玉米蛋白和β-胡萝卜素溶解于二氯甲烷和乙醇的混合溶剂中(体积比为9:5)，超临界CO2流速为4kg/h，根据本课题组的前期研究[16]，实验选取芯材比、温度、压力3个主效因子作为响应面试验的因素，β-胡萝卜素的负载量和包埋率作为响应值。各个因素的水平选择范围为芯材比1:10～1:30、温度35～55℃、压力8～16MPa。响应面各因素及水平如表1所示。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels in response surface design

优化试验设计及数据分析采用响应面法中的Box-Behnken中心组合设计原理，利用Design-Expert 7.1.6软件设计3因素3水平的响应面法试验，共有17个试验点，其中12个为析因点，5个为零点以估计误差，试验设计和结果见表2。

表2 Box-Behnken设计方案及响应值结果Table 2 Box-Behnken matrix design scheme and response values

2.2 方差分析

2.2.1 β-胡萝卜素负载量

利用软件对试验结果进行二次多元回归拟合，得到模型的二次多项回归方程为：

Y1=2.40200-1.79250A＋0.74000B-1.19750C-0.46250AB＋1.30250AC-0.57250BC＋0.56275A2＋0.077750B2＋0.052750C2(1)

表3 方差分析Table 3 Variance analysis for the established regreesion model for β-carotene loading

由表3可知，失拟项不显著(P=0.4730＞0.05)，模型的P值为0.0003，表明模型极显著。从表3中可以看出因素一次项A、B、C、交互项AC对试验的影响极显著。同时软件方程的决定系数R2=0.9648，表明该模型拟合程度良好，该模型是合适的。在所选取的因素水平范围内，因素对结果的影响排序为芯材比＞压力＞温度。

压力和芯材比对载药量(Y1)的响应面如图2所示，由于响应面的最大值出现在设计范围的边缘，根据二次多项式(1)给出的信息，对β-胡萝卜素负载量进行预测，在芯材比1:10、温度55℃、压力8MPa时，载药量可以达到9.16%。在此条件下进行验证实验，得到β-胡萝卜素负载量为8.73%。说明模型可靠。

图2 压力和芯材比对β-胡萝卜素负载量的影响Fig.2 Resposne surface plot for the interative effects of pressure and core/wall ratio onβ-carotene loading

2.2.2 β-胡萝卜素包埋率

根据Design-Expert 7.1.6软件所做的分析，得到二次拟合回归方程：

决定系数R2=0.9154，表明该模型可以较好的解释β-胡萝卜素包埋率的变化。根据上面的方程绘制的压力和芯材比对包埋率的Y2响应面分析如图3所示。结合方程和响应面分析图可知，β-胡萝卜素包埋率的最大值点出现在边缘，由二次拟合回归方程(2)可预测当反应条件为芯材比1:30、温度35℃、压力16MPa，最大包埋率可达84.3%。经实验验证，在此工艺条件下β-胡萝卜素的包埋率达到85.4%。

图3 压力和芯材比对β-胡萝卜素包埋率的影响Fig.3 Resposne surface plot for the interative effects of pressure and core/wall ratio onβ-carotene embeded rate

2.3 负载β-胡萝卜素的玉米蛋白纳米粒表征

2.3.1 形貌及粒径分析

图4 负载β-胡萝卜素的玉米蛋白纳米粒SEM图(a)和粒径大小分布图(b)Fig.4 SEM image and particle size distribution

图4 是负载β-胡萝卜素的玉米蛋白纳米粒(反应条件为芯材比1:10、温度55℃、压力12MPa)的SEM照片和粒径大小分布图。由图4a可见，产品呈均匀的球形颗粒，粒径在100～200nm之间，颗粒之间稍有团聚。纳米粒度仪对样品的测试结果如图4b所示，样品的平均粒径在150nm左右，粒径分布窄，与SEM的测试结果相似。

2.3.2XRD分析

β-胡萝卜素、玉米蛋白纳米粒、β-胡萝卜素与玉米蛋白物理混合颗粒以及抗溶剂法制备的负载β-胡萝卜素玉米蛋白纳米粒的XRD分析如图5所示，由此可以看出，β-胡萝卜素在2θ为10～25°有很强的特征衍射峰(图5a)；单独的玉米蛋白纳米粒(图5b)微球没有显示特征衍射峰，只有两个软物质的宽峰；对比图5c和图5d可以看出，物理混合与抗溶剂法制备的β-胡萝卜素和玉米蛋白复合物中，β-胡萝卜素的存在形式是不一样的，微球物理混合的(图5c)特征衍射峰比较明显，说明物理混合没有改变β-胡萝卜素的晶型，或者β-胡萝卜素没有被玉米蛋白完全包封，而在超临界二氧化碳抗溶剂法制备的负载β-胡萝卜素的玉米蛋白纳米粒中，β-胡萝卜素的特征衍射峰大部分消失了，这可能是超临界二氧化碳抗溶剂过程导致β-胡萝卜素的结晶度下降，造成了特征峰的消失，同时也可能是β-胡萝卜素被玉米蛋白完全包封了，其特征峰无法显现。

图5 XRD衍射图谱Fig.5 XRD spectra image

3 结 论

3.1 采用响应面设计优化SAS法制备负载β-胡萝卜素的玉米蛋白复合物纳米粒，确定了影响载药量和包埋率的主要因素及最优工艺条件。芯材比对载药量和包埋率的影响最显著，其次是压力，最后是温度。当芯材比1:10、温度55℃、压力8MPa时，β-胡萝卜素的负载量达到最大值8.73%；当芯材比1:30、温度35℃、压力16MPa时，β-胡萝卜素的包埋率达到最高值85.4%。

3.2 制备的负载β-胡萝卜素的玉米蛋白纳米粒呈均匀球形，颗粒粒径分布在100～200nm之间；β-胡萝卜素在物理混合的样品与抗溶剂法制备的样品中的存在形式有较大差异。

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Optimizing Supercritical Anti-solvent Preparation of β-carotene-loaded Zein Nanospheres by Response Surface Methodology

SUN Li-jun1，LIN Chang-chun1，ZHAO Xiang-yu2，ZHAO Ya-ping1,*
(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China；2. School of Chemistry and Material Engineering, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Response surface methodology was used to optimize the preparation of β-carotene-loaded zein nanospheres by supercritical anti-solvent technique. The effects of the ratio between β-carotene and zein, temperature, and pressure as well as interactions among them on β-carotene loading and embedding rate were investigated, and the morphology, particle size and structure of β-carotene-loaded zein nanospheres were characterized by SEM, DLS and XRD. The results indicated that core/wall ratio had the most significant effect on β-carotene loading and embedding rate, sequentially followed by pressure and temperature. β-carotene loading reached its maximum level of 8.73%, when the β-carotene/zein ratio was 1:10, the temperature 55 ℃, and the pressure 8 MPa. β-carotene showed a maximum embedded rate of 85.4% under the following conditions: β-carotene/zein ratio of 1:30, temperature of 35 ℃, and pressure of 16 MPa. The structure of β-carotene-loaded zein particles was a matrix, the average particle size was about 150 nm with a narrow distribution, and the spherical degree was high.

supercritical CO2；β-carotene；zein；response surface methodology

TQ460.62

A

1002-6630(2011)08-0019-05

2010-07-17

国家“863”计划项目(2007AA10Z350)；国家自然科学基金项目(20976103)

孙丽君(1984—)，女，硕士研究生，研究方向为超临界二氧化碳制备纳米营养物。E-mail：lijunsun2008@sjtu.edu.cn

*通信作者：赵亚平(1962—)，男，教授，博士，研究方向为超临界流体在化学、化工过程中的应用。E-mail：ypzhao@sjtu.edu.cn