超临界CO2状态下直接酯化法制备共轭亚油酸甘油酯

李默馨，刘 晶，周晓丹，高宇薇，于殿宇*

(东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

超临界CO2状态下直接酯化法制备共轭亚油酸甘油酯

李默馨，刘 晶，周晓丹，高宇薇，于殿宇*

(东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

在超临界CO2状态下，采用脂肪酶催化共轭亚油酸(conjugated linoleic acid，CLA)与甘油反应制备共轭亚油酸甘油酯，分别应用单因素和正交试验考察分子筛添加量、酶用量、反应压力、温度和时间对CLA酯化率的影响。结果表明，最佳工艺条件为分子筛用量6%、酶用量4%、反应温度60℃、反应时间20h、反应压力11MPa，此条件下CLA的酯化率可达到90.98%。这种CLA甘油酯的脂肪酸组成中，9c,11t-CLA和10t,12c-CLA的含量分别为37.79%和41.66%。

超临界CO2；共轭亚油酸；甘油酯；CLA酯化率

共扼亚油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是亚油酸的一组位置和几何异构体的通称，科学证实9c,11t-CLA和10t,12c-CLA具有抑制肿瘤、抗动脉粥样硬化、降低生物体脂肪等生理活性[1-2]。天然的共轭亚油酸主要存在于瘤胃动物牛、羊等的乳汁和肉制品中，但含量很少[3]，鉴于CLA的这些生理功能，人们一直期望在膳食中含有一定量CLA的同时提高其吸收率。但CLA以游离酸的形式存在时，易氧化，口感不好，且不易被身体吸收[4-5]，因此制备CLA的甘油酯产品，具有广阔的应用前景。

CLA甘油酯产品的获得主要有化学法和酶法两种。传统应用于食品、医药、化工等行业的甘油酯产品主要是采用化学法催化油脂甘油制得的[6]，但此法存在着反应温度高、化学污染严重、产物色泽差等缺点；目前，国内外多以酶催化法合成，该法在有机溶剂和无溶剂中反应都取得了较好进展，但在超临界二氧化碳(SC-CO2)状态酶法催化合成CLA甘油酯尚未见相关报道。SC-CO2状态下酶反应，是近年来生物工程新开拓的领域[7]。当CO2达到临界温度(31.1℃)和压力(7.28MPa)以上时，CO2显示出较大的溶解能力和较高传递特性，从而可大大降低酶反应过程的传质阻力，提高酶反应速率[8]；另外，SC-CO2无毒、不可燃、化学惰性佳、易与反应物底物分离[9]。这些优点和特点使其在食品工业上的应用具有广阔的发展前景。本实验以CLA和甘油为原料，对超临界状态下酶法合成CLA甘油酯进行研究，探讨反应压力、温度、时间、底物物质的量比、分子筛添加量和酶用量对酯化率的影响，为工业生产中有效获得CLA甘油酯提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

共轭亚油酸(80%) 青岛澳海有限公司；CLA标准品 美国Sigma公司；Novozym 435脂肪酶(酶活1340U/g)丹麦若维信公司；甲醇(色谱纯)、甘油(分析纯)、正己烷(色谱纯)、氢氧化钾(分析纯)、3A分子筛 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

SHA-CA水浴恒温振荡器 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；高压反应釜 江苏太仓市医疗器械厂；7890A气相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司；高速离心机 北京医药公司；XW-80A微型旋涡混合仪 上海沪西分析仪器厂；AR2140电子精密天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶促酯化的方法

在反应釜中按3:1的物质的量的比加入CLA与甘油，同时加入转子和一定量的脂肪酶、分子筛，将反应釜密封后充入少量CO2以置换出反应釜中的空气，同时试漏，确定反应釜密封情况良好后，在加压泵的作用下充入CO2使反应釜内达到一定压力，然后将反应釜置于水浴锅中，调节转速至100r/min，在一定温度下反应一定时间。

1.3.2CLA的测定与分析

取1.3.1节中液体产物3～5滴，称质量，采用无水硫酸钠过滤除去水分，以体积分数1% H2SO4-甲醇甲酯化[10]后溶于正己烷，供气相色谱分析。CLA的含量通过利用CLA标准品绘制的标准曲线算出。

气相色谱分析方法参考Eulitz等[11]的方法。

1.4CLA酯化率计算

式中：C0为反应初始体系中CLA的单位含量(g/g)；Ct为反应完毕后体系的游离CLA的单位含量(g/g)。

1.5 甘油酯的纯化

反应完毕后，取出转子，将反应釜内的物质在高速离心机的作用下离心除去固定化脂肪酶、分子筛和水。取上述物质溶于正己烷中，加入酚酞指示剂，用0.1mol/L KOH-乙醇滴定，直至出现粉红色。加水洗分层，取上层旋转蒸发除去残存的溶剂[12]，得到共轭亚油酸甘油酯。

2 结果与分析

2.1 反应条件对CLA酯化率的影响

2.1.1 分子筛添加量对CLA酯化率的影响

分子筛添加量分别为2%、4%、6%、8%和10% (质量分数)时，酶用量2%(质量分数)、反应压力8MPa、反应温度50℃、反应时间15h，分子筛添加量对CLA酯化率的影响见图1。

图1 分子筛添加量对CLA酯化率的影响Fig.1 Effect of type 3A molecular sieve amount on CLA esterification

由图1可知，分子筛添加量对CLA酯化率的影响较显著。CLA酯化率随着分子筛添加量的增加而提高，这主要是由于CLA与甘油反应的副产物水分子能够及时被分子筛吸收，反应才能够持续向正向进行。当分子筛添加量达到6%时，CLA的酯化率为69.37%，分子筛用量继续增加时，CLA酯化率的提高并不显著，反而有下降的趋势。这可能是由于酶反应主要在环绕着酶分子的水层内进行，底物分子必须先进入微水相，才能与酶作用，激发酶的活性[13]，当分子筛添加量过高时，体系中的水分子被分子筛吸收的过多，反而不利于酶反应的进行。因此分子筛添加量为6%较为适宜。

2.1.2 酶用量对CLA酯化率的影响

酶用量分别取1%、2%、3%、4%和5%时，分子筛添加量6%、反应压力8MPa、反应温度50℃、反应时间15h，酶用量对CLA酯化率的影响见图2。

图2 酶用量对CLA酯化率的影响Fig.2 Effect of Novozym 435 lipase on CLA esterification

在超临界高压下，脂肪酶活力基本不受影响[14]。随着酶用量的增加CLA的酯化率也随之提高，但当酶用量达到3%以上时，CLA酯化率的增加趋势并不明显，这可能是由于酶用量过高时催化反应速率加快，分子筛用量相对不足，不能吸收产生的水分子，导致反应不能及时向正向进行。同时脂肪酶价格较高，出于成本考虑，酶用量选择3%最为适宜。

2.1.3 反应压力对CLA酯化率的影响

反应压力分别取8、9、10、11、12MPa时，分子筛添加量6%、酶用量3%、反应温度50℃、反应时间15h，反应压力对CLA酯化率的影响见图3。

图3 反应压力对CLA酯化率的影响Fig.3 Effect of pressure on CLA esterification

由图3可知，压力对脂肪酶本身体系影响不大，主要是它影响了SC-CO2的性质，从而影响反应速率及酯化率[15]。一般随着反应压力的增加，反应速率加快，从而可相应缩短反应时间，当压力达到11MPa以上时，CLA酯化率的提高并不明显，因此反应压力11MPa较为适宜。

2.1.4 反应温度对CLA酯化率的影响

反应温度分别取40、50、60、70、80℃时，分子筛添加量6%、酶用量3%、反应压力11MPa、反应时间15h，反应温度对CLA酯化率的影响见图4。

图4 反应温度对CLA酯化率的影响Fig.4 Effect of temperature on CLA esterification

由图4可知，当温度从40℃升至60℃时，CLA的酯化率随之逐渐上升，这说明随着温度的升高脂肪酶的催化活性部位逐渐暴露，发挥出较强的活性。当温度达到60℃时，脂肪酶催化活性达到极值，之后酯化程度开始下降，这有可能是由于较高温度致使酶部分失活而引起的。可见，Novozym 435在催化酯化反应的最佳温度在60℃左右。

2.1.5 反应时间对CLA酯化率的影响

反应时间分别取5、15、25、35、45h时，分子筛添加量6%、酶用量3%、反应压力11MPa、反应温度60℃，反应时间对CLA酯化率的影响见图5。

图5 反应时间对CLA酯化率的影响Fig.5 Effect of reaction time on CLA esterification

催化酯化反应过程中，Novozym 435通常所需时间较长，多在24～48h，但反应时间过长会直接影响酶的活力和重复利用。由图5可知，随着反应时间的延长，CLA的酯化率不断提高，但当反应时间达到25h后上升效果并不显著，这是因为随着反应时间延长，底物浓度和酶活力开始降低，反应速度逐渐减小，酯化率的增长趋于平缓，体系基本达到平衡。综合考虑反应时间以25h为宜。

2.2 最佳工艺参数的确定

表1 CLA酯化反应正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

表2 CLA酯化反应正交试验设计及结果Table 2 Scheme and experimental result of orthogonal array design

在单因素试验基础上，保持反应压力11MPa，选择分子筛用量、酶用量、反应温度和反应时间设计四因素三水平正交试验(每一组合中安排了3次重复试验)，从而优化超临界CO2状态下酶法合成CLA甘油酯的反应条件。

表3 方差分析结果Table 3 Variance analysis for CLA esterification

由表2极差分析结果可知，各因素对CLA酯化率影响的主次顺序为分子筛添加量＞酶用量＞反应温度＞反应时间。由正交试验结果的直观分析可知，最优组合为A2B3C2D1，即反应条件为分子筛添加量6%、酶用量4%、反应温度60℃、反应时间20h。

由表3方差分析结果可知，A因素在α=0.1水平显著，D因素SS值相对较小，可作为误差项，由于没有交互作用，故为加性模型，即A、B与C的好水平组合表现一定好，因而可由直观分析判断有A2B3C2参加的处理表现一定好于其他处理。

由于正交试验中无此组合，因最佳提取工艺不包含在正交试验设计表内，为了进一步验证结论的准确性，进行了验证实验。结果证明此条件下CLA的酯化率可达到90.98%。

2.3 共轭亚油酸的GC分析

图6 CLA标准品的GC图Fig.6 GC chromatography of CLA standard

图7 CLA甘油酯的GC图Fig.7 GC chromatography of CLA glyceride

CLA标准品、CLA甘油酯中脂肪酸组成情况的GC分析结果如图6、7。

由图6可知，在CLA标准品中，具有生理活性的CLA异构体，即9c,11t-CLA和10t,12c-CLA的含量分别为49.34%和48.74%，保留时间分别为46.803min和47.316min。在反应产物的GC图(图7)中，9c,11t-CLA和10t,12c-CLA分别在46.818min和47.342min时出现，含量分别为37.79%和41.66%，即反应产物的脂肪酸组成中，具有生理活性的脂肪酸含量高达79.45%。

3 结 论

在超临界CO2状态下酶法制备CLA甘油酯，通过单因素和正交试验的研究，确定最佳的制备工艺：分子筛添加量6%、酶用量4%、反应温度60℃、反应时间20h、反应压力11MPa，结果表明，此条件下CLA的酯化率可达到90.98%。CLA甘油酯的脂肪酸组成中，9c,11t-CLA和10t,12c-CLA的含量分别为37.79%和41.66%。此方法产生的CLA甘油酯属天然，绿色的结构脂质，能够满足特殊人群对CLA的需求。

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Preparation of Conjugated Linoleic Acid Glyceride by Direct Esterification under Supercritical Carbon Dioxide

LI Mo-xin，LIU Jing，ZHOU Xiao-dan，GAO Yu-wei，YU Dian-yu*
(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

The lipase-catalyzed preparation of conjugated linoleic acid glyceride (CLA) from conjugated linoleic acid and glycerin under supercritical CO2was studied. The effects of the quantities of molecular sieve and enzyme addition, pressure, temperature and time on the esterification rate of CLA were investigated. The results showed that the optimal parameters for preparing CLA were as follows: in the attendance of 6% type 3A molecular sieve and 4% Novozym 435 lipase, reaction at 60 ℃ and 11 MPa for 20 h. Under these conditions, the esterification rate of CLA reached 90.98%. The contents of 9c,11t-CLA and 10t,12c-CLA was 37.79% and 41.66%, respectively in the CLA glyceride prepared.

supercritical CO2；conjugated linoleic acid (CLA)；glyceride；esterification rate of CLA

TS229

A

1002-6630(2011)08-0029-04

2010-10-17

国家“863”计划项目(2010AA101503)

李默馨(1985—)，女，硕士研究生，研究方向为农产品加工及贮藏工程。E-mail：moxin89152936@163.com

*通信作者：于殿宇(1964—)，男，教授，硕士，研究方向为大豆加工技术。E-mail：dyyu2000@yahoo.com.cn