HPLC法测定铁皮石斛饮料中D-甘露糖的含量

杨兵勋，沈春香，王 增，陈立钻，楼正家，吴人照，夏克中

(浙江天皇药业有限公司，浙江 杭州 310012)

HPLC法测定铁皮石斛饮料中D-甘露糖的含量

杨兵勋，沈春香，王 增，陈立钻，楼正家，吴人照，夏克中

(浙江天皇药业有限公司，浙江 杭州 310012)

目的：建立铁皮石斛饮料中D-甘露糖(D-Man)含量的测定方法。方法：样品分别经乙醇沉淀、盐酸水解和衍生化处理。色谱柱使用Agilent EclipseXDB-C18(4.6mm×250mm，5μm)； 20mmol/L乙酸铵-乙腈溶液(80.5: 19.5)为流动相；流速1.0mL/min；检测波长250nm。结果：样品中西洋参多糖对甘露糖含量测定无干扰；样品中D-甘露糖在7.815～312.6μg/mL 范围内，线性关系均良好，相关系数r=0.9997；样品回收率为99.66%，RSD为1.76%(n=6)。结论：本方法专属性强、灵敏、精确、重现性好，可用于本品多糖组成中D-Man含量的测定。

铁皮石斛饮料；D-甘露糖；高效液相色谱法；含量测定

铁皮石斛饮料(Dendrobium officinale Kimuraet Migo beverage，DOB)主要原料为铁皮石斛和西洋参，是采用水提等制备工艺制备而成的保健饮料，具有养胃生津、滋阴降火、提高机体免疫功能的功效，其主要功效成分为铁皮石斛多糖。文献报道，铁皮石斛多糖主要含有多糖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，相对分子质量分别为1000000、500000和120000，多糖水解物主要含甘露糖(Man)、葡萄糖，还含有微量的阿拉伯糖和木糖[1-4]。Man等单糖成分多为己糖结构，在紫外区无吸收，直接采用紫外法或HPLC法无法测定。目前对Man等单糖类成分多采用示差折光检测器，但示差检测器检测灵敏度低，且不能梯度洗脱[5]。本研究采用先将DOB中铁皮石斛多糖水解成单糖，并与1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)进行衍生化后，再行HPLC法测定DOB中D-Man的含量。该方法专属性强、重现性好，旨在为功能性饮料品控提供一种有效的控制手段。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

铁皮石斛饮料(批号：091021-1)及缺铁皮石斛的阴性制剂饮料 浙江天皇药业有限公司。

乙腈(色谱纯) 德国Merck公司；对照品D-甘露糖(D-Man) (批号：200301，含量：99%) 中国药品生物制品检定所；内标盐酸氨基葡萄糖(HAG，纯度99.0%～101.0%) 国药集团化学试剂有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP，分析纯) 上海晶纯试剂有限公司。水为亚沸高纯水(自制)；其余试剂均为分析纯。

1100液相色谱仪、色谱工作站(A.09.01版) 美国Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 对照品溶液的制备

精密称取D-Man对照品、内标HAG适量，加水制成每1mL含D-Man 0.1mg、内标盐酸氨基葡萄糖0.1mg的溶液，并进行衍生化，分离收集上清液，即得对照品溶液。

1.2.2 供试品溶液的制备

样品提取：精密吸取铁皮石斛饮料1mL于具塞试管中，精密加入无水乙醇4mL，放置1h，4000r/min离心20min，倒出上清液，再加入80%乙醇溶液5mL洗涤，4000r/min离心20min，倒出上清液，沉淀置水浴挥去残留乙醇，再精密加入内标HAG溶液(0.2mg/mL)3mL，水浴溶解混匀，得多糖样品提取液。

样品水解：取含多糖样品提取液1mL置于安瓿瓶中，加3mol/L HCl溶液0.5mL，封口，110℃反应1h，冷却后用NaOH中和至中性，得样品水解液。

样品衍生化：取样品水解溶液、0.3mol/L NaOH溶液、0.5mol/L PMP甲醇溶液各400μL，置于具塞离心管中，密塞，70℃衍生化反应100min，放冷，加0.3mol/L HCl溶液0.5mL，用2mL三氯甲烷萃取，共2次，水层液离心，收集上清液，即得供试品溶液。

1.2.3 色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Agilent EclipseXDB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：20mmol/L乙酸铵-乙腈溶液(80.5:19.5)；流速：1.0mL/ min；柱温：30℃；检测波长：250nm；进样量10μL。

2 结果与分析

2.1 专属性实验

取缺铁皮石斛的阴性制剂饮料，照1.2.2节方法制备缺铁皮石斛饮料阴性对照溶液；分别吸取对照品、供试品和缺铁皮石斛饮料阴性对照溶液各10μL，分别进样，进行色谱测定。结果发现，色谱峰分离度良好，且阴性对照溶液对D-Man的测定无干扰(图1)，表明本法专属性强。

图1 Man HPLC谱图Fig.1 HPLC chromatograms of iron free DOB (containing no internal standard), control (containing no internal standard), test sample and control (containing internal standard)

2.2 重复性实验

取铁皮石斛饮料，照1.2.2节方法分别制备6份样品，按1.2.3节色谱条件进行测定，结果所测D-Man的峰面积RSD为0.72%，表明本法重复性好。

2.3 精密度实验

取同一对照品溶液连续进样6针，测定D-Man峰面积，其RSD为0.29%，说明仪器的精密度符合要求。

2.4 稳定性实验

取供试品溶液连续5d进样测定D-Man峰面积，结果5d所测结果RSD为0.18%，表明本样品溶液在室温条件下5d内是稳定的。

2.5 线性关系考察

分别配制质量浓度为0.007815、0.015630、0.031260、0.062520、0.125040、0.312600mg/mL的D-Man工作溶液，内含盐酸氨基葡萄糖质量浓度为0.12186mg/mL，按1.2.2节方法分别进行衍生化，并按照1.2.3节色谱条件测定DMan峰面积。以D-Man质量浓度(C，mg/mL)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线图，其回归方程为：A=1.3641C-0.0239，r=0.9997，说明D-Man在7.815～312.6μg/mL范围内，线性关系均良好。

2.6 回收率实验

精密吸取铁皮石斛饮料6份，每份各 0.5mL，分别置于具塞试管中，按照1.2.2节方法提取，向提取物中各精密加入内标盐酸氨基葡萄糖溶液0.12186mg/mL、DMan 0.06252mg/mL 的混合溶液3mL，再按照1.2.2节方法制备样品。最后按1.2.2节色谱条件测定D-Man峰面积，并计算回收率(表1)。结果显示，6份样品所测平均回收率为99.66%，RSD为1.76%，表明本方法回收率符合要求。

表1 回收率实验结果Table 1 Spike recovery of the method

2.7 样品中D-Man含量的测定

取不同批号的铁皮石斛饮料，按1.2.2节方法处理，照1.2.3节色谱条件测定，并计算产品中D-Man的含量，结果见表2。

表2 铁皮石斛饮料中D-Man含量测定结果(n=3)Table 2 Man concentrations in different batches of DOB determined by HPLC (n=3)

3 讨 论

DOB是采用水提等制备工艺将铁皮石斛和西洋参制备而成的保健饮料，其主要活性成分为铁皮石斛多糖。D-Man是铁皮石斛多糖主要构成成分之一，其分子为己糖结构，在紫外区无吸收，直接采用紫外法或HPLC法无法测定。目前对Man等糖类成分多采用示差折光检测器，但示差检测器检测灵敏度低，且不能梯度洗脱。通过衍生化使糖类化合物生成具有紫外吸收或能发射荧光的物质是提高糖类HPLC检测灵敏度的主要手段[5-7]。

Man与PMP中吡唑啉酮基作用生成PMP-Man衍生物，衍生物中含有苯基结构，在250nm波长处有强紫外吸收。同时，衍生化后改变了糖的化学结构，更有助于分离。本研究采用先将DOB中铁皮石斛多糖水解成单糖后与PMP进行衍生化，再行HPLC法测定D-Man的含量。结果显示，本法不仅灵敏、专属性强、分离度高，可适用于本品质控，而且采用先将铁皮石斛多糖水解成单糖后再测定D-Man的含量，避免了制剂中人为加入的干扰。

本研究对铁皮石斛多糖水解条件进行比较，结果显示，对本法制样量用3mol/L HCl 0.5mL，110℃反应1h即可水解完全；此外，本研究还对D-Man衍生化的条件进行了优化，结果表明，采用本实验衍生化条件可使D-Man衍生化反应彻底。

铁皮石斛多糖是铁皮石斛的主要活性成分，含量高达29%以上[8-9]。文献报道，石斛类药材还含有微量的石斛碱、石斛醚、毛兰素、鼓槌联苄等小分子物质[10-15]；目前，铁皮石斛药材及其制剂仅采用硫酸苯酚显色法测定多糖含量进行质量控制。该法显著缺点是不能准确判断所测多糖的来源，即铁皮石斛多糖，专属性差；最近，比较研究32种石斛中多糖含量、多糖构成等，结果发现，铁皮石斛多糖中的D-Man、葡萄糖、半乳糖具有较恒定的比例关系。铁皮石斛多糖中以上3种单糖质量比为140:35:1，且主要单糖构成不同于其他石斛(另文发表)。因此，对DOB以及铁皮石斛类其他制剂采用测定多糖、多糖中主要单糖的含量及其比例关系等综合手段将是未来铁皮石斛类制剂质量控制发展的方向之一。

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Determination of Mannose in Dendrobium officinale Kimuraet Migo Beverage by HPLC

YANG Bing-xun，SHEN Chun-xiang，WANG Zeng，CHEN Li-zuan，LOU Zheng-jia，WU Ren-zhao，XIA Ke-zhong
(Zhejiang Tianhuang Medicinal Plant Pharmaceutical Co. Ltd., Hangzhou 310012, China)

Objective: To establish a HPLC method to determine the content of D-mannose (D-Man) in Dendrobium officinale Kimura et Migo beverage (DOB). Methods: Ethanol precipitation followed by hydrochloric acid hydrolysis and derivatization was carried out for sample preparation. Mannose was separated on an Agilent Eclipse XDB-C18 (4.6 mm × 250 mm, 5μm) using a mobile phase made up of 20 mmol/L ammonium acetate and acetonitrile (80.5:19.5, V/V) at a flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 250 nm. Results: No interference was found from Panacis quinquefolium in DOB. The linear range of Man was between 7.815μg/mL and 312.6μg/mL (r = 0.9997). The average recovery was 99.66% (RSD 1.76%, n = 6). Conclusion: This method is specific, sensitive, accurate and reproducible and may therefore be applicable for the determination of D-Man in DOB.

Dendrobium officinale Kimura et Migo beverage；D-mannose；HPLC

R917

A

1002-6630(2011)08-0275-03

2010-06-25

杨兵勋(1963—)，男，高级工程师，博士，主要从事药品及保健食品研究。E-mail：Yangbx001@yahoo.com.cn