成年大鼠侧脑室下区增殖细胞的变化及其关系

臧全金 赵波 贺西京 李浩鹏

传统观点认为成年哺乳动物中枢神经系统不可再生，一旦损伤，只能进行瘢痕修复。近年来中枢神经系统存在增殖细胞的发现打破了这一观点，研究发现在成年哺乳动物体内存在增殖细胞，以侧脑室下区（SVZ区）以及海马齿状回为最多[1-2]；损伤后，脑组织及脊髓组织生成神经干细胞来对损伤部位进行修复。近年来研究发现星形胶质细胞除了形成胶质瘢痕外，在受到损伤刺激后能够表达神经干细胞的特异性标记物神经上皮干细胞蛋白(neuroepithelial stem cell protein)又名nestin蛋白物[3-5]，体外培养能够形成神经球。星形胶质细胞的增生是否和神经干细胞有关、星形胶质细胞是否能够表达干细胞的功能尚且不得而知，因此研究损伤后两者之间的表达变化及其关系有一定的意义。

1 材料与方法

1.1 侧脑室下区神经干细胞的培养 颈椎脱臼处死大鼠，取侧脑室下区细胞。机械性分离过滤。酶化学法分离细胞，细胞浓度2×105/ml接种于含bFGF、B27的无血清培养基中。于5%CO2培养箱中培养，观察换液。对形成的细胞行nestin免疫细胞荧光化学染色鉴定。

1.2 建立脑损伤模型 利用自制的Feeney装置，自由落体打击大鼠脑部。

1.3 脑损伤后行免疫组化及免疫荧光染色：成年SD大鼠48只，雌雄各半，200～250g。随机分为正常组（6只）、假手术组以及模型组（42只）。模型组分为脑损伤后3d、5d、7d、2w、3w、4w组。动物取材前24h由腹腔注射生理盐水溶解的BrdU，剂量200mg/kg。灌注取材，制作冰冻组织切片。组织切片进行BrdU、GFAP及nestin的免疫组织化学以及GFAP和nestin的免疫荧光双重标记染色。

1.4 图像采集 采集侧脑室下区5个视野, 测量单位面积BrdU、nestin、GFAP吸光度(A)值的变化。

1.5 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件包,对BrdU、nestin、GFAP在脑损伤不同时间点侧脑室下区中的免疫染色结果进行比较,所有数据用均数±标准差表示。采用单因素方差分析，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞培养结果 倒置相差显微镜下观察细胞悬液：细胞呈圆形，体积较小，胞体透明，折光性强。培养后逐渐可见部分悬浮细胞开始分裂。并逐渐形成神经球。神经球行nesin免疫荧光染色鉴定显示：神经球呈nesin+反应（图1、图2）。

2.2 模型建立 应用Feeney模型成功制作出损伤程度较一致的脑损伤模型。

图1 细胞培养后可见形成神经球

图2 神经球FITC标记nestin染色阳性

2.3 免疫染色结果 GFAP+星形胶质细胞普遍存在于正常组脑中，但是损伤后细胞肿胀、肥大,突起增多，变长。正常组SVZ区可见少量nestin+细胞，胞体较细小，突起较长，染色较弱。损伤后3d开始染色变深，阳性细胞增多。且在第7d阳性细胞数量最多，从第2周开始细胞数量开始减少。在第4周GFAP+细胞以及nestin+细胞数量逐渐减少至正常水平，细胞形态和正常组相比基本一致。各时间点免疫荧光双重标记未见有GFAP、nestin双表达，所见均为单标阳性（图3）。

图3 脑损伤后2周SVZ区FITC标记的nestin和TRITC标记的GFAP双重染色，未见双重染色细胞，其他各时间点亦未见双重染色细胞（10×20）

表1 脑损伤后各时间点与正常组、假手术组各指标吸光度（A值）的比较

2.4 统计学结果

如表1所示：脑损伤后3d到2w侧脑室下区BrdU、GFAP以及nestin表达与正常组相比都有统计学意义（与正常组比较P＜0.05），损伤后3w GFAP、nestin与正常组相比也具有统计学意义。损伤后4w以及假手术组与正常组相比无统计学意义。

3 讨论

正常组和脑损伤后不同时间点的成年大鼠在神经干细胞的培养中都能够形成克隆球，并且免疫鉴定为nestin阳性。损伤组较正常组较增殖能力弱，形成克隆球的速度明显快。单细胞克隆法传代后发现仍然能够形成神经克隆球，免疫鉴定为阳性，说明具有稳定传代的能力，具有神经干细胞的增殖特性。损伤后各时间点BrdU阳性细胞明显增多，并且从侧脑室下区向周围进行迁移，损伤后增殖细胞数量增多，并且向损伤部位进行迁移，可能对损伤修复起重要作用。GFAP阳性细胞在正常即存在于大脑各个部位，在损伤后反应性地增多，与传统观点损伤后星形胶质细胞反应性增多相符合。统计学分析发现GFAP阳性细胞在损伤后第3d开始增多，第7d增生最明显。Nestin为神经干细胞的标记物，阳性说明细胞为神经干细胞。BrdU、GFAP、nestin三者损伤后都较正常组都增多，并且在3、5、7d时增生显著，7d时最明显，表明星形胶质细胞和神经干细胞之间可能具有某种关系。应用GFAP和nestin双重标记损伤后组织，在侧脑室下区未见到GFAP+/nestin+双重标记细胞，说明两者之间可能存在关系，但不能表明星形胶质细胞表达干细胞的功能。关于星形胶质细胞和神经干细胞之间的关系有2种可能:一种是星形胶质细胞反应性增生，逆向分化表达神经干细胞的功能；另一种可能是神经干细胞部分分化表达星形胶质细胞的功能。这两者之间的关系尚需要进一步的研究。

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