鸡柔嫩艾美耳球虫YL株多次传代后的致病性研究*

黄 妮,贾燕青,梁武龙,林 青,于三科

(西北农林科技大学动物医学院,陕西杨陵 712100)

鸡柔嫩艾美耳球虫YL株多次传代后的致病性研究*

黄 妮,贾燕青,梁武龙,林 青,于三科*

(西北农林科技大学动物医学院,陕西杨陵 712100)

为研究多次传代后的鸡柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)YL株的致病性,分别以不同剂量的36代次柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊感染7日龄雏鸡,通过临床症状、死亡率、血便程度、潜隐期、盲肠病变、平均增重及每克粪便卵囊数(OPG)对其致病性进行评价。结果显示,不同剂量孢子化卵囊感染雏鸡均在感染后3 d～4 d出现血便,球虫在感染雏鸡体内的潜隐期为110 h;高剂量组(1×106个/羽)、中剂量组(1×105个/羽)和低剂量组(1×104个/羽)感染雏鸡较对照组的相对增重率分别是72%、74%和77%,盲肠病变记分分别是2、1.68和0.86;不同剂量感染雏鸡粪便中卵囊产出大致呈正态分布,其中,中剂量组的卵囊产量均高于高剂量组与低剂量组。表明经过多次传代的E.tenellaYL株具有较强的致病性,且感染剂量与其致病性呈正相关,卵囊产出呈现“拥挤效应”。

柔嫩艾美耳球虫;致病性;感染剂量

*通讯作者

鸡球虫病(Coccidiosis)是由艾美耳属(Eimeria)球虫引起的一种以血便,在雏鸡上高发病率和死亡率为特征的肠道寄生性原虫病[1]。该病被认为是养禽业最严重的寄生虫疾病,每年世界范围内给养禽业带来的损失超过8.0亿美元[2]。迄今,公认的病原主要是顶复器门的7种球虫,即柔嫩、巨型、堆型、布氏、毒害、和缓和早熟艾美耳球虫,其中柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)是毒力最强的鸡球虫之一[3]。从20世纪50年代以来,化学合成的抗球虫药物对于养鸡业的快速发展起了十分重要的作用。但是,由此却产生了耐药性、药物残留和毒副作用等问题。因此,球虫疫苗成为鸡球虫病更有前景的防控手段[4]。鸡球虫疫苗研制途径之一是通过卵囊的连续传代,缩短潜隐期,选择早熟株,降低其毒力[5]。本文通过人工感染雏鸡多次传代的柔嫩艾美耳球虫杨凌株(E.tenellaYL)孢子化卵囊,对其致病性进行了研究,为球虫疫苗的研制以及鸡球虫病的防控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 1日龄健康尼克红小公雏,为杨凌华英种畜禽有限公司产品。

1.1.2 试验虫株 鸡柔嫩艾美耳球虫单卵囊分离技术分离纯化的E.tenellaYL孢子化卵囊[6],由西北农林科技大学兽医寄生虫学实验室保存。试验前将E.tenellaYL株经人工感染无球虫鸡进行多次传代,目前已获得36代次卵囊,该卵囊置于25 g/L重铬酸钾溶液中29℃下孢子化,4℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 感染方法 试验前检查雏鸡未感染球虫卵囊;接雏前对饲养用的鸡笼和所有用具严格消毒;在严格无球虫环境下,饲喂不加任何抗球虫药的全价配合饲料,自由采食和饮水,饲料经烘烤消毒,饮水经煮沸消毒;给予24 h的光照,饲喂期间保证笼内温度在28℃～30℃。

7日龄时,将试验用小公雏随机分为4组,每组30羽。除对照组外,其余3组分别以每羽1×104个、1×105个、1×106个孢子化卵囊口服接种。接种前孢子化卵囊使用蒸馏水反复洗涤,去除重铬酸钾,以少许饮水送服。接种后观察鸡只的精神状况、死亡情况、血便出现最早时间;测定平均增重和相对增重率;通过饱和食盐水漂浮法,每日检查2次卵囊,计算每克粪便中的卵囊数(oocysts per gram faeces,OPG);记录粪便中卵囊最早排出时间,即为该感染剂量的潜隐期;感染后第10天扑杀全部存活鸡,剖检收集盲肠,并按Johnson J等[7]所述方法记录盲肠病变记分。

1.2.2 病变指数及评判标准

1.2.2.1 盲肠病变记分 盲肠病变记分标准按5级记分:未见病变,为0分;盲肠壁散在极少数的点状出血斑,肠壁不增厚,内容物正常,为1分;盲肠内容物混有少量血液,盲肠壁肥厚,可见很多出血病灶,为2分;盲肠内大量血液或盲肠凝块(凝血或灰白色的拴芯),盲肠壁肥厚,盲肠明显地变形或萎缩,为3分;盲肠显著萎缩,病变延伸至直肠,盲肠壁极度肥厚,盲肠内容物为凝血或拴芯,为4分。算出各试验组平均每只雏鸡的病变记分平均值。

1.2.2.2 粪便记分 参考 Morehouse和 Baron(1970)标准[8],按血便程度不同划分为5个等级:粪便正常不带血,记0分;粪便中带有少量血,记为1分;粪便中带有较多量血,其他正常,记2分;粪便中带有较多量血,其他为白色黏液或1/3是血,记3分;全部为血便或粪便中2/3的血,其他为白色黏液 ,记 4 分。

1.2.2.3 卵囊记分 采集试验组在接种后110 h至200 h的新鲜粪便,用麦克马斯特法计数,分别计算各组鸡OPG值。

2 结果

2.1 不同感染剂量的致病性结果

用1×104个/羽、1×105个/羽、1×106个/羽 3种剂量的E.tenellaYL株孢子化卵囊接种7日龄雏鸡,分别对感染后雏鸡存活率、最早血便出现时间、血便程度、潜隐期、平均病变记分、相对增重率进行检测。由表1可见,感染剂量越大,出现血便的时间就越早,量也越多,病理变化越严重,体重增加越低,潜隐期缩短,直到感染剂量达到1×106个/羽,不再缩短。多数鸡只呈现战栗畏寒,拥挤成堆,精神萎靡,翅膀低垂,羽毛蓬松,食欲降低。第 10天,剖检鸡,盲肠多肿大,扭曲,粗细不规则,内容物混有血液,盲肠壁有少数散在性出血,还有个别可见柱状红棕色肠芯。虽然未见死亡,但是试验组增重均比对照组显著降低(P＜0.05),各试验组血便记分均比对照组差异显著(P＜0.05),各试验组较对照组病变记分差异显著(P＜0.05)。由此可见,柔嫩艾美耳球虫YL株的孢子化卵囊经过多次传代之后,致病力仍然较强。

2.2 不同感染剂量对于卵囊产出的影响

不同剂量感染雏鸡卵囊产出曲线大致呈正态分布(图1)。感染后110 h,卵囊产量与感染剂量呈正相关;随着感染时间持续,各感染剂量雏鸡排出卵囊数逐渐升高并达到最高值,且感染剂量与卵囊高峰值检出时间呈负相关;至感染后200 h,雏鸡排出卵囊数降低或者检测不到。各时间段,卵囊产出量多以中剂量感染组为高。

图1 雏鸡感染不同剂量E.tenella YL株后不同时间的OPG值Fig.1 OPG values at different hours after inoculation with different dosages of E.tenella YL strain

3 讨论

鸡球虫病给养禽业带来巨大的危害,在临床上,因肠道上皮的损害而导致饲料报酬的降低,鸡生产性能的下降,体重增加缓慢甚至高水平的死亡率[9]。从本试验可以看出,柔嫩艾美耳球虫对雏鸡的增重有很大影响,且剂量越大,对增重的影响越大。这与王仲兵等[10]研究结果相一致。柔嫩艾美耳球虫主要侵害盲肠,并造成严重的病理损伤[11]。本实验室之前相关研究表明[12],当感染剂量为1×103个/羽时,未传代柔嫩艾美耳球虫YL野毒株感染雏鸡后,其盲肠病变记分可达到2.5～3.0,感染雏鸡相对增重率减少可达17.7%。本研究结果表明,各感染剂量柔嫩艾美耳球虫虽然对雏鸡体重增重有明显影响,但经过多次传代后的虫株致病性有所减弱。Joegensen W K等[13]也报道将强毒力柔嫩艾美耳球虫对雏鸡连续感染传代能够获得低毒力的疫苗候选虫株。

球虫感染鸡后产出的卵囊量是球虫的一个重要的生物学指标,但与其致病性强弱没有必然的联系[14]。随着感染剂量的增加,卵囊产量也会逐渐增多,但当感染水平达到一定限度时,若继续提高感染剂量,卵囊产量反而逐渐降低,每个卵囊的繁殖能力也会逐渐降低,潜隐期不再继续缩短,即出现“拥挤效应”。拥挤效应的出现是由多种因素共同作用的结果,除了可供虫体寄生的肠上皮细胞有限之外,还与宿主对寄生虫产生的免疫反应有关[15]。从本研究结果看出,柔嫩艾美耳球虫YL株感染剂量在1×106个/羽时也表现出明显的“拥挤效应”。由此可见,在利用柔嫩艾美耳球虫进行疫苗免疫效果和抗球虫药物的防治效果进行评价时,攻虫剂量的选择是至关重要的。

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[4]Sharman P A,Smith N C,Wallach M G,et al.Chasing the g olden egg:vaccination against poultry coccidiosis[J].Parasite Immunol,2010,32(8):590-598.

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[9]Wallach M.Role of antibody in immunity and control of chicken coccidiosis[J].T rends Parasitol,2010,26(8):382-387.

[10]王仲兵,古少鹏.柔嫩艾美耳球虫的分离鉴定与致病性测定[J].中国动物检疫,2010,27(9):36-37

[11]Zhou B H,Wang H W,Wang X Y,et al.Eimeria tenella:Effects of diclazuril treatment on microneme genes expression in second-generation merozoites and pathological changes of caeca in parasitized chickens[J].Exp Parasitol,2010,125(3):264-270.

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Study on Pathogenicity ofEimeria tenellaYL Strain after Several Passages

HUANG Ni,JIA Yan-qing,LIANG Wu-long,LIN Qing,YU San-ke

(College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi,712100,China)

To study the pathogenicity of multiple passagedEimeria tenella,Seven-day-old chickenswere infected with sporulated oocysts of 36 passageEimeria tenellaYL strain at different dosages.The pathogenicity was assessed by clinical symptom,mortality,degree of bloody diarrhea,latent period,cecal lesions,average weight gain(AWG),and oocysts per gram faeces(OPG).The results revealed that the bloody stools were discharged from infected chickens at 3-4 days post-inoculation and the latent period showed to be 110 h.The relative weight gain(RWG)of high dosage group(1×106/per bird),middle dosage group(1×105/per bird)and low dosage group(1×104/per bird)were 72%,74%,77%,respectively,compared with control group.The cecal lesion scoresof high dosage,middle dosage,and low dosage were 2,1.68,and 0.86,respectively.The oocyst yields of different dosages roughly showed normal distribution.However,middle dosage group yielded the most oocysts among different treatments.Result showed thatEimeria tenellaYL strain had high pathogenicity in chickens although it was passaged for many timesand the infective dosage showed positive correlation with the pathogenicity.The oocyst output from infected chickens showed the“crowd effect” .

Eimeria tenella;pathogenicity;infective dose

S852.723

A

1007-5038(2011)09-0027-03

2011-05-18

黄 妮(1987-),女,湖北松滋人,硕士研究生,主要从事动物寄生虫防控研究。