海参岩藻聚糖硫酸酯抑制小鼠肿瘤生长和转移及其作用机制的研究

张 珣，王静凤，杨玉红，常耀光，薛长湖

(中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛 266003)

海参中含有海参多糖、海参皂苷、脂肪酸和多肽等多种生物活性物质，具有抗肿瘤、抗衰老和降血脂等多种生理功效［1］。多糖是海参体壁的主要成分，包括硫酸软骨素及岩藻聚糖硫酸酯(fucoidan，FUC)两种组分。海参硫酸软骨素的结构和生理活性被广泛关注，研究表明其具有抗凝血、抗血栓、免疫调节和抗肿瘤等生理活性［2－3］。而海参岩藻聚糖硫酸酯是一类主要由岩藻糖及硫酸酯基团组成的多糖类物质，通常结构较为简单，而且硫酸酯化形式规律。几十年来，人们深入研究了褐藻岩藻聚糖硫酸酯的结构和活性，但对于海参岩藻聚糖硫酸酯生物学功能的研究甚少且较零散［4］。目前，仅见海参岩藻聚糖硫酸酯(sea cucumber fucoidan，SC-FUC)有免疫调节作用［5］和抑制破骨细胞生成的作用［6］，对其抗肿瘤作用的研究未见报道。

本文选取了从美国肉参(Isostichopus badionotus)中制备的SC-FUC，采用小鼠Lewis肺癌自发性肺转移模型，对SC-FUC抑制肿瘤生长和转移的作用及其机制进行探讨，为低值海参的高值化利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验材料美国肉参干品，购自青岛市南山海参市场;C57BL/6J小鼠，♀，SPF 级，17 ～18 g，购自北京维通利华实验动物中心，许可证号2007-001;小鼠高转移Lewis肺癌细胞，购自中科院上海细胞库，于RPMI 1640培养基中(内含10%胎牛血清、1×105U·L－1青霉素、100 mg·L－1链霉素)，37℃ 、5%CO2、饱和湿度条件下培养，0.25%胰酶消化、每2～3天细胞传代1次。

1.1.2药品和试剂RPMI1640培养基和胎牛血清，美国Gibco公司产品;注射用环磷酰胺为上海华联制药有限公司产品;小鼠 HPA、HIF-1α、MMP-9、MMP-2、VEGF及β-actin引物，均由上海生工生物技术有限公司合成;Taq酶、M-MLV，日本TaKaRa公司产品。

1.1.3主要仪器TC-96 Life Pro基因扩增仪，杭州博日科技有限公司产品;培清JS-780全自动凝胶成像分析仪，上海培清科技有限公司产品;2711型CO2培养箱，德国Heraeus公司产品;TGL-16G型台式离心机、WGP-300型隔水恒温培养箱，上海安亭科学仪器厂产品;DL-CJ-1N型超净工作台，北京东联哈尔仪器制造有限公司产品;SZ-51型解剖镜，O-lympus公司产品;镀铬游标卡尺，江西工具厂产品。

1.2方法

1.2.1SC-FUC的制备将美国肉参干品粉碎，于丙酮中浸泡脱脂24 h，室温下晾干。向干物中(以下提取步骤均按照1 g干物计算)加入30 ml木瓜蛋白酶解液，于60℃水浴下搅拌反应24 h，离心。向上清液中加入1.6 ml质量分数为10%的CPC溶液后，弃上清，沉淀溶解于15 ml 3 mol·L－1NaCl∶乙醇(100 ∶15，V/V)溶液中，4℃放置24 h，离心，弃去沉淀。向上清液中继续加入20 ml体积分数为0.95的乙醇溶液沉淀，所得沉淀用30 ml体积分数为0.8和体积分数为0.95的乙醇洗2～3次。去上清，将沉淀干燥，蒸馏水溶解，用截流分子量为6 000 u的中空纤维膜超滤并脱盐，浓缩，冻干，得到海参粗多糖。

取400 mg海参粗多糖溶于10 ml 25 mmol·L－1NaH2PO4－NaOH(pH 6.3)缓冲盐溶液中，过DEAE-52阴离子交换柱，采用 0～1.4 mol·L－1NaCl缓冲盐溶液进行梯度洗脱，流速为0.5 ml·min－1，每10 min收集1管。并通过液相 TSK4000柱子检测组分单一的管，收集后透析，真空冷冻干燥，得到岩藻聚糖硫酸酯的纯品。经 TSK G4000PWXL色谱柱测定，分子量达435 ku。PMP柱前衍生法测定单糖组成，单糖仅含有岩藻糖，离子色谱法测定其硫酸基含量约为32.9%。

1.2.2动物模型的建立和实验收集Lewis肺癌细胞，制成单细胞悬液，取0.2 ml(含瘤细胞1×106)接种于小鼠右腋窝皮下。体内传代10次，无菌条件下取接种10 d的Lewis肺癌实体瘤，按瘤块(g)∶生理盐水(ml)为1∶3的比例制成单细胞悬液，取0.2 ml(含瘤细胞2×106)接种于C57BL/6J小鼠右腋窝皮下［7］。接种次日，随机分为模型对照组、阳性对照组(CTX)和SC-FUC低、高剂量组，每组10只。剂量组分别腹腔注射SC-FUC(10和20 mg·kg－1)，阳性对照组腹腔注射环磷酰胺(20 mg·kg－1)，模型对照组腹腔注射生理盐水。注射体积为0.2 ml·(10 g·bw)－1，每天1 次，连续21 d。小鼠于末次给药后，禁食不禁水12 h，脱颈椎处死，仔细剥离原位肿瘤，称重，于冰上取0.1 g肿瘤组织，置液氮中冻存备用。取双侧肺，用Bouin's液固定。

1.2.3肿瘤生长曲线荷瘤小鼠接种12 d后，每隔2 d用游标卡尺实际测量肿瘤的最大直径A(cm)和最小直径B(cm)，按下式计算各组肿瘤体积V(cm3)的大小。肿瘤体积(cm3)=(1/2)AB2，计算各组肿瘤平均体积，绘制肿瘤生长曲线，比较各组小鼠肿瘤的生长情况。

1.2.4肿瘤生长抑制率抑瘤率/%=(1－剂量组平均瘤重/模型对照组平均瘤重)×100%。

1.2.5肺转移抑制率将Bouin's液固定后的双肺在解剖镜下计数肺表面转移灶结节数(＞2 mm)，计算:转移抑制率/%=(1－剂量组平均转移灶数/模型对照组平均转移灶数)×100%。

1.2.6RT-PCR法检测肿瘤组织转移相关基因mRNA的表达采用TRIzol法提取总RNA，采用两步法RT-PCR检测各组小鼠原位肿瘤组织中目的基因HIF-1α、VEGF、HPA、MMP-9 和 MMP-2mRNA 的表达量。PCR反应条件为:94℃预变性5 min，94℃变性45 s，退火 30 s，72℃延伸 45 s，最后 72℃延伸 10 min，不同基因的引物设计和实验条件见Tab 1。产物经1%琼脂糖凝胶电泳，并进行条带的灰度扫描，以β-actin作为内参校正，目的基因的相对表达量用目的基因的灰度值与β-actin灰度值的比值表示。

Tab 1 The designed primers and reaction condition for detecting different genes

1.3数据分析数据分析采用SPSS11.0软件进行单因素方差分析，同时进行LSD两两比较，实验结果用±s表示。

2 结果

2.1SC-FUC对肿瘤生长曲线的影响由Fig 1可见，接种肿瘤细胞12 d后，荷瘤小鼠肿瘤体积明显增大，SC-FUC剂量组小鼠肿瘤体积比模型对照组明显要小，高剂量组的效果优于低剂量组，环磷酰胺阳性对照组小鼠肿瘤体积最小，各组小鼠肿瘤体积的增长速度差异具有显著性。

2.2SC-FUC对荷瘤小鼠原位瘤生长的抑制作用由Tab 2所示，低、高剂量组SC-FUC均能抑制小鼠Lewis肺癌原位肿瘤的生长，其抑瘤率分别为31.4% 和59.7%，以高剂量SC-FUC的效果较好。

Fig 1 Growth curve of tumor in mice(±s，n=10)

2.3SC-FUC对荷瘤小鼠肿瘤转移的影响由Tab 2可见，与模型对照组相比，SC-FUC剂量组小鼠肺转移灶结节数降低(P＜0.01)，低、高剂量组的转移抑制率分别为54.0%和77.9%。由Fig 2所示，模型对照组双侧肺转移结节数目较多，且体积较大，而SC-FUC低、高剂量组肺转移结节数目少而且体积小，多分布在单侧。结果提示，SC-FUC可以抑制Lewis肺癌细胞小鼠肿瘤肺转移的发生。

Tab 2 Effect of SC-FUC on tumor growth and metastasis of Lewis lung carcinoma cell in mice(±s，n=10)

Tab 2 Effect of SC-FUC on tumor growth and metastasis of Lewis lung carcinoma cell in mice(±s，n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model

Group Tumor weight/g Inhibition rate/%Nodule number Inhibition rate/%Model 4.39 ±0.73 0 11.3 ±2.99 0 CTX 1.41 ±1.39＊＊ 69.3 0 100 SC-FUC low 3.02 ±1.84* 31.4 5.2 ±1.57* 54.0 SC-FUC high 1.81 ±0.89＊＊ 59.7 2.5 ±0.71＊＊77.9

Fig 2 Metastatic tumor foci on lung surface in mice

2.4SC-FUC对HIF-1α和VEGF mRNA表达的影响HIF-1α是缺氧条件下肿瘤组织中广泛表达的一种因子，而VEGF作为HIF-1α的靶基因是最重要的促血管生长因子［8］。有研究表明［9］，HIF-1α 和VEGF对肿瘤血管的形成及生长起着至关重要的作用。PCR结果表明，模型对照组小鼠肿瘤组织中HIF-1α和 VEGF mRNA高表达，给予 SC-FUC后，HIF-1α和VEGF mRNA的表达量下降(P＜0.05，P＜0.01)，分别平均下降了33.60%和39.42%(Fig 3)。

2.5 SC-FUC对HPA和MMP-2、MMP-9 mRNA表达的影响肿瘤细胞基底膜和细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)的降解，主要依靠乙酰肝素酶、基质金属蛋白酶和纤溶酶等［10］。PCR结果表明，SC-FUC能抑制 HPA、MMP-2和 MMP-9的 mRNA表达(P＜0.05，P＜0.01)，与模型对照组相比，SC-FUC剂量组3者mRNA表达分别平均减少了12.55%、35.64%和29.91%(Fig 4)。

3 讨论

采用Lewis肺癌自发肺转移肿瘤模型，对SCFUC抑制肿瘤生长和转移的作用进行了研究，并对其作用机制进行了探讨。结果发现，SC-FUC可以抑制小鼠肿瘤的生长，低、高剂量组的抑瘤率分别为31.4%和59.7%;同时，SC-FUC抑制了肿瘤细胞的肺转移，抑制率分别为54.0%和77.9%。结果提示，SC-FUC在小鼠体内具有抑制肿瘤生长和转移的作用。

硫酸基含量与多糖的活性密切相关，硫酸化程度高的多糖往往具有良好的生理活性，Kayanagi等［11］研究发现过硫酸化的褐藻多糖硫酸酯可以增强对肿瘤血管内皮生长因子的抑制作用增强其抗肿瘤活性。Teruya等［12］进一步研究表明，经过硫酸化修饰将岩藻聚糖硫酸化程度由13.5%增加到32.8%，可以明显增强其抗肿瘤活性。美国肉参SC-FUC是一种天然的硫酸多糖，硫酸化程度高，其硫酸根含量为32.9%，由此推测其抗肿瘤生长和转移的作用可能与高硫酸化程度有关。

Lewis肿瘤细胞增生过快必然会造成局部组织严重缺氧，处于缺氧状态的肿瘤细胞仍能不断增殖和浸润，其主要原因之一是缺氧引起肿瘤细胞的一些基因和蛋白的表达发生改变，其中起枢纽作用的是转录因子HIF-1α。研究证实HIF-1α在人体许多肿瘤中大量表达，对肿瘤的生长、血管形成、转移及凋亡皆有影响［13］。另有研究发现［14］，HIF-1α 不仅使其靶基因VEGF的mRNA稳定性增加，而且能增加VEGF的转录活性。本实验中，SC-FUC各剂量组中HIF-1α和 VEGF mRNA的表达均下降(P＜0.05)，并且呈现了较好的相关性，提示SC-FUC可以通过降低肿瘤组织缺氧条件下HIF-1α及其靶基因VEGF的表达，抑制血管新生和肿瘤转移。

Fig 3 Effect of SC-FUC on the expressions of HIF-1α and VEGF of tumor in mice(±s，n=10)

Fig 4Effect of SC-FUC on the expression of HPA and MMP-2/9 of tumor in mice(±s，n=10)

ECM的降解是肿瘤侵袭转移的关键步骤之一，主要依靠蛋白水解酶的作用，基质金属蛋白酶是(matrixmetallop roteinases，MMPs)是目前研究最多的。大量的实验表明，肿瘤细胞侵袭、转移能力与其产生或诱导MMPs的能力密切相关［15］。实验结果显示，SC-FUC能降低肿瘤组织中MMP-2/9 mRNA的表达，抑制肿瘤细胞在基质中的侵袭和迁移能力。

另有研究表明［16］，乙酰肝素蛋白聚糖(heparin sulphate proteoglycans，HSPG)作为ECM的另一主要成分，其降解也是肿瘤细胞侵袭转移的重要环节。HPA可以降解HSPG，释放结合在HSPG上的生长因子，促进肿瘤细胞的侵袭和转移。Zetser等［17－18］研究发现，HPA的高表达可以提高肿瘤细胞中VEGF的表达，促进血管新生。结果发现，SC-FUC剂量组荷瘤小鼠肿瘤组织中HPA的表达降低，提示SC-FUC通过下调HPA的表达，抑制了肿瘤细胞的侵袭和血管新生。

综上所述，SC-FUC可能是通过抑制在缺氧条件下肿瘤组织中HIF-1α的表达，抑制其靶基因VEGF的表达，来达到抑制肿瘤血管新生的作用。同时，SC-FUC还可以抑制HPA、MMP-2/9的表达，减少了ECM的降解，降低肿瘤细胞在ECM中的侵袭和转移能力。SC-FUC可以抑制Lewis荷瘤小鼠肿瘤的生长和自发性肺转移，为海参多糖的应用提供理论依据，其结构和作用的关系还有待进一步研究。

［1］韩 华，易杨华，喇明平，等.糙海参皂苷Scabraside A、B的抗真菌和抗肿瘤活性［J］.中国药理学通报，2008，24(8):1111－2.

［1］Han H，Yi Y H，La M P，et al.Studies on antifungal and antitumor activities of scabraside A、B from Holothuria scabra Jaeger［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(8):1111 －2.

［2］胡人杰，于苏萍，姜 卉，等.刺参酸性粘多糖与可的松联用方案对小鼠肿瘤的抑制作用［J］.癌症，1997，16(6):422－5.

［2］Hu R J，Yu S P，Jiang H，et al.The inhibitory effect of SJAMP combined with cortisone on murine solid tumors［J］.Chin J Cancer，1997，16(6):422 －5.

［3］牛娟娟，宋 杨.刺参黏多糖的生物活性物质的研究进展［J］.华北煤炭医学院学报，2009，11(5):651－2.

［3］Niu J J，Song Y.Study on the biological activity of SJAMP［J］.J North China Coal Med Univ，2009，11(5):651 －2.

［4］Mulloy B，Ribeino A，Alves A.Sulfated fucans from echinoderms have a regular tetrasaccharide repeating unit defined by specific patterns of sulfation at the O-2 and O-4 position［J］.J Biol Chem，1994，269(35):22113 －23.

［5］黄益丽，郑忠辉，苏文金，等.二色桌片参的化学成分研究Ⅲ.二色桌片参多糖-1-岩藻聚糖的免疫调节作用［J］.海洋通报，2001，20(1):88－91.

［5］Huang Y L，Zheng Z H，Su W J，et al.Studies on the chemical composition of sea cucumber mensamaria intercedensⅢ.Immunomodulative effects of PMI-1［J］.Mar Sci Bull，2001，20(1):88 －91.

［6］Kariya Y，Mulloy B，Imai K，et al.Isolation and partial characterization of fucan sulfates from the body wall of sea cucumber Stichopus japonicus and their ability to inhibit osteoclastogenesis［J］.Carbohydr Res，2004，25(2):1339 －46.

［7］徐晓玉，严鹏科，陈 刚，廖端芳.川芎嗪对小鼠肺癌血管生长和VEGF表达的抑制［J］.中国药理学通报，2004，20(2):151－4.

［7］Xu X Y，Yan P K，Chen G，Liao D F.Inhibition of tetramethylpyrazine on Lewis lung carcinomas，microvessel growth and VEGF expression in mice［J］.Chin Pharmacol Bull，2004，20(2):151－4.

［8］Carmeliet P.Angiogenesis in health and disease［J］.Nat Med，2003，9(6):653 －60.

［9］Oh S H，Woo J K，Jin Q，et al.Identification of novel antiangiogenic anticancer activities of deguelin targeting hypoxia-inducible factor-1 alpha［J］.Int J Cancer，2008，122(1):5 － 14.

［10］Starnenkovic I.Extracellular matrix remodeling:the role of matrix metalloproteinases［J］.J Pathol，2003，200(4):448 － 64.

［11］Koyanagi S，Tanigawa N，Nakagawa H，et al.Oversulfation of fucoidan enhances its anti-angiogenic and antitumor activities［J］.Biochem Pharmacol，2003，65(2):173 －9.

［12］Teruya T，Konishi T，Uechi S，et al.Anti-proliferative activity of oversulfated fucoidan from commercially cultured Cladosiphon okamuranus TOKIDA in U937 cells［J］.Int J Biol Macromol，2007，41(3):221－6.

［13］孙 军，李 岩.姜黄素对人肝癌细胞BEL-7402中HIF-1α表达的影响［J］.中国药理学通报，2006，22(11):1379－83.

［13］Sun J，Li Y.Effects of curcumin on expression of HIF-1α in human hepatocellular carcinoma BEL-7402 cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2006，22(11):1379 －83.

［14］Damert A，Machein M，Breier G，et al.Up-regulation of vascular endothelial growth factor exp ression in a rat glioma is conferred by two distinct hypoxia-driven mechanisms［J］.Cancer Res，1997，57(17):3860－4.

［15］Stamenkovic I.Matrix metalloproteinases in tumor invasion and metastasis［J］.Semin Cancer Biol，2000，10(6):415 －33.

［16］Vlodvas I，Eldor A，Haimovitz Firedman A，et al.Expression of heparanase by platelets and circulating cells of the immune system:Possible involvement in diapedesis and extrvaasation［J］.Invasion Metastasis，1992，12(2):112 －27.

［17］Zetser A，Bashenko Y，Edovitsky E，et al.Heparanase induces vascular endothelial growth factor expression:correlation with p38 phosphorylation levels and Src activation［J］.Cancer Res，2006，66(3):1455－63.

［18］Zetser A，Bashenko Y，Miao H Q，et al.Heparanase affects adhesive and tumorigenic potential of humanglioma cells［J］.Cancer Res，2003，63(22):7733 －41.