阿片受体激动剂U50，488H通过Cx43介导的抗心律失常作用与抑制钙通道有关

王 微，吴晓东，时全星，樊 荣，裴建明

(第四军医大学1.口腔医学系、2.基础部生理学教研室，陕西 西安 710032)

缺血性心律失常的发病机制尚未得到彻底阐明。已有研究证明致命性的室速或室颤都与心室肌细胞间缝隙连接(Gap junction，GJ)的主要构成蛋白Connexin43(Cx43)在结构与功能上的重塑有关［1］。作为一个钙相关的功能蛋白［2］，Cx43 的重塑与细胞内钙在心肌缺血时发生的瞬间变化密切相关［3］。近年来阿片受体及其激动剂对缺血心肌的保护作用正成为国内外研究的热点，与心血管功能调节有关的阿片受体分为μ、δ、κ 3种亚型，其中以κ阿片受体分布占主导［4］。我们以往对κ阿片受体的研究显示，选择性受体激动剂U50，488H激动κ阿片受体后，可通过抑制交感递质的释放、抑制β受体的作用、抑制L型钙通道、以及影响心室肌Cx43的重塑等途径来抑制缺血性心律失常的发生［5－10］。本研究通过在大鼠心肌缺血模型中先后给予钙通道激动剂(Bay k8644)和U50，488H，观察κ阿片受体的抗心律失常作用及对抗Cx43重塑的调节作用是否被翻转，来判断U50，488H是否通过抑制钙通道减少外钙内流参与了κ阿片受体的抗缺血性心律失常作用。

1 材料与方法

1.1材料健康♂SD大鼠30只，体质量250～350 g，由第四军医大学实验动物中心提供。微型动物呼吸机由第二军医大学仪器厂生产。RM－6280智能多道生理记录仪及分析处理软件由第四军医大学设计，成都仪器厂生产。Bio-Rad化学发光仪及其所配置的Quantity One软件由加拿大Bio-Rad公司设计和生产。U50，488H及Bay k8644均购自Tocris公司，Western blot所用小鼠抗Cx43抗体购自Abcam公司(ab11369)，小鼠抗Tubulin抗体购自上海碧云天公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠抗体购自北京ZSGB-BIO公司，RT-PCR所用TRIzol试剂及逆转录试剂盒均购自日本TaKaRa公司。

1.2急性心肌缺血动物模型的建立用30 g·L－1戊巴比妥钠麻醉大鼠(1.5 ml·kg－1，ip)，常规记录肢体Ⅱ导联心电图，并输入多道生理记录仪进行全程同步连续记录。分离左侧股静脉，建立给药途径。气管插管，微型动物呼吸机给予正压人工呼吸。而后于大鼠胸骨左缘第4-5肋间开胸，暴露心脏，剪开心包膜，在冠状动脉左前降支(LAD)距左心耳下缘约2 mm处穿线(6/0丝线)，以备结扎，再用直径约0.2 cm细塑料管穿过结扎线，稳定15 min后进行心肌缺血，即用止血钳夹紧结扎线。以心电图ST段明显抬高，结扎线以下心肌颜色改变为心肌缺血标志。缺血30 min后取大鼠左心室前壁缺血区心肌组织为样本。

1.3动物模型试验分组将所有大鼠编号，随机分成以下5组:① 对照组(Sham)，仅穿线而未结扎LAD，观察时间过后直接取材。②缺血组(Isc)，结扎LAD，给予心肌缺血30 min后取材。③缺血+U50，488H组(Isc+U50)，结扎LAD前10 min经股静脉给予 U50，488H(1.5 ml·kg－1)，余同②。④缺血 +U50，488H+Bay k8644 组(Isc+U50+Bay)，结扎LAD前15 min经股静脉给予钙通道激动剂Bay k8644(66.7 μg·kg－1)，余同 ③。⑤缺血 +Bay 组(Isc+Bay)，结扎LAD前15 min经股静脉给予Bay k8644(66.7 μg·kg－1)，给予心肌缺血 30 min 后取材。

1.4心律失常评分标准采用Curtis和Walker建立的心律失常评分标准［11］并予以改良，把心肌缺血的总过程分为平均时长为3 min的10个段，分别记录每3 min内的心律失常发生情况，具体评分细则如下:0=每3 min内出现小于10个室性早搏;1=每3 min内出现10到50个室性早搏;2=每3 min出现大于等于50个室性早搏;3=每3 min内出现1段室颤;4=每3 min内出现2到5段室颤;5=每3 min内出现大于5段室颤。最后，由各组中各时段的评分累加，综合分析得出结果。

1.5Cx43蛋白表达观察将心肌组织溶解于含有1 mmol·L－1蛋白酶抑制剂(antipain)，联苯胺(benzamidine)，亮抑蛋白酶肽(leupeptin)，胃蛋白酶抑制剂(pepstatin A)，苯甲基磺酰氟(PMSF)，质量浓度为0.1的十二烷硫酸钠(SDS)，以及5 mmol·L－1乙二胺四乙酸(EDTA)的PBS缓冲液提取出总蛋白，采用聚丙烯酰胺凝胶进行蛋白质电泳并转印至PVDF膜上，依次加用小鼠抗Cx43多克隆抗体(内参为小鼠抗Tubulin抗体)及HRP标记的羊抗小鼠抗体进行孵育，运用Bio-Rad化学发光仪显色曝光，并应用配套软件Quantity One记录和分析结果。

1.6Cx43mRNA表达观察用TRIzol试剂提取出心肌组织中的总RNA，依照Cx43——5'-GCG GCTTGCTGAGAACC-3'，5'-TTGCGGCACGAGGAATT-3';HPRT(内参)——5'-CTCATGGACTGATTATGGACA GGACTG-3'，5'-CAGCGCTTTAATGTAATCCAGCAGGTC-3'的序列设计引物并进行逆转录，依照Cx43——94℃ 5 min，(94℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72℃60 s)进行 28 次循环，72℃ 10 min;HPRT—— 95℃3 min(95℃ 90 s，60℃ 120 s)进行 30 次循环，60℃10 min的条件进行cDNA的扩增。采用质量浓度为0.015的琼脂糖凝胶进行DNA电泳，运用Bio-Rad化学发光仪曝光，并应用配套软件Quantity One记录和分析结果。

1.7统计学处理实验数据以±s表示，组间均数比较采用方差分析，两组间比较采用t检验。

2 结果

2.1Bay k8644对U50，488H介导的抗缺血性心律失常作用的影响心肌缺血后，心律失常评分明显上升，提示缺血诱发心律失常。若在缺血前给予κ阿片受体激动剂U50，488H，心律失常评分明显下降(P＜0.05)，提示U50，488H具有抗缺血性心律失常作用。当缺血前先给予钙通道激动剂Bay k8644再给予U50，488H时，U50，488H的抗心律失常作用即被翻转(P＜0.05)。而单独给予 Bay k8644对缺血心肌的心律失常评分没有影响(Fig 1)。

Fig 1 Effect of Bay k8644 on the anti-arrhythmic effect mediated by U50，488H(±s，n=6)

2.2Bay k8644对U50，488H调节Cx43蛋白表达的影响心肌缺血时大鼠心室Cx43蛋白表达明显下降(P＜0.01)。若在缺血前给予U50，488H，大鼠心室肌Cx43蛋白表达明显恢复(P＜0.01)，提示U50，488H对缺血心肌Cx43具有保护性上调作用。若先给予钙通道激动剂 Bay k8644再给予U50，488H，κ阿片受体激动剂对Cx43的上述保护性调节作用即被阻断(P＜0.01)。而缺血前单独给予Bay k8644降低了缺血心肌Cx43蛋白表达，但与缺血组相比没有统计学意义(Fig 2)。

Fig 2 Effect of Bay k8644 on the regulation of Cx43 protein expression mediated by U50，488H(±s，n=6)

2.3Bay k8644对U50，488H调节Cx43 mRNA表达的影响心肌缺血时大鼠心室Cx43 mRNA表达明显增高(P＜0.01)。若在缺血前给予U50，488H，大鼠心室肌Cx43 mRNA表达明显降低(P＜0.01)。当缺血前先给予钙通道激动剂Bay k8644再给予U50，488H，κ阿片受体激动剂对Cx43 mRNA的这种调控作用即被翻转(P＜0.01)。缺血前单独给予Bay k8644对缺血心肌Cx43 mRNA表达并无影响(Fig 3)。

3 讨论

当心肌发生缺血时，交感神经兴奋导致递质释放增加，通过心肌细胞β肾上腺素受体(β受体/Gs蛋白/腺苷酸环化酶/cAMP/蛋白激酶PKA/Ca2+)的信号传导通路，细胞内钙发生瞬时变化，出现钙超载［12］、钙振荡［13］等与心律失常的发生密切相关的现象。我们前期关于κ阿片受体对这条信号通路影响的研究工作也表明，心肌缺血时以U50，488H激动κ阿片受体后，可抑制交感递质的释放及β受体的作用［6，8］，亦可直接抑制 L 型钙通道降低心肌细胞的钙瞬变和收缩力［7］，从而发挥抗心律失常作用。本研究整体动物水平的实验结果表明，钙通道激动剂Bay k8644能够翻转U50，488H的抗缺血性心律失常作用(P＜0.05)，说明在导致细胞内钙超载的这条通路上，U50，488H通过抑制钙通道开放，减少外钙内流，从引起细胞内钙升高的源头上阻断了钙超载等现象的发生，从而发挥它的抗缺血性心律失常作用。

Fig 3 Effect of Bay k8644 on the regulation of Cx43 mRNA expression mediated by U50，488H(±s，n=6)

减轻细胞内钙超载的措施亦可抑制Cx43的重塑(Cx43基因表达的变化、数量改变以及磷酸化水平的改变)及其后发生的GJ间脱偶联的过程［1］，这一过程可导致折返性电活动的发生，最终引起严重的室性心律失常［14］。Cinca 等［15］的工作表明，缺血预处理在减小梗死面积的同时，还可以抑制GJ的脱偶联和迟发时相室颤的发生，这与预处理使儿茶酚胺释放减少而降低细胞内钙，从而抑制了缺血引起的Cx43去磷酸化和细胞内重新分布及GJ的脱偶联过程有关。还有研究表明［16］，直接激活外周迷走神经可通过保护Cx43的功能而抗缺血性心律失常，其中间的重要机制就是兴奋迷走神经可降低细胞内钙的水平。

在本研究中，U50，488H对心肌细胞Cx43在蛋白和基因表达水平的保护性调节作用均为钙通道激动剂Bay k8644所翻转，再次验证了U50，488H是通过减轻细胞内钙超载来对Cx43进行稳定性调控从而发挥抗心律失常作用的，Bay k8644的翻转作用正说明U50，488H对细胞内钙升高的减轻来源于对钙通道的抑制和对外钙内流的阻断。尤其值得说明的是，在缺血组及缺血+U50，488H组中，我们观察到了U50，488H对抗缺血心肌Cx43异常下降的蛋白表达和异常升高的mRNA表达的作用，这与我们先前研究的发现一致［9］，被认为是 U50，488H 平衡了心肌细胞在急性缺血状态下过度的自我保护机制与代偿机制两种效应之后达到的稳定性效果。

目前临床上常用的钙通道阻滞剂药物，机制多为直接作用于心肌细胞的钙通道抑制外钙内流，通过抑制兴奋—收缩偶联减少心肌ATP消耗，延长房室结不应期以及减慢心室率等效应实现对缺血心肌的保护及抗心律失常作用［17］。与κ阿片受体激动剂相比，未见关于其对缺血性心律失常发生的关键因素—心肌细胞Cx43蛋白有调节作用的报道，并且它也不具备κ-阿片受体激动剂使用后对缺血性损伤事件的预防性效果。

综上，本研究初步证明了U50，488H可能通过抑制钙通道减少外钙内流，参与κ阿片受体对缺血心肌Cx43的稳定性调控及抗缺血性心律失常作用。而在钙通道之后，κ阿片受体如何具体调控细胞内钙浓度的变化从而影响Cx43表达的机制尚有待于进一步研究。

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