黄芩苷对牙龈卟啉单胞菌生物膜的抑菌实验研究

张广平

慢性牙周炎是由微生物感染引起的牙周组织的慢性炎症性疾病，是成年人缺牙的主要原因。牙龈卟啉单胞菌(Pg)是慢性牙周炎最主要的致病菌之一［1］。黄芩苷抑菌抗炎的药理作用，但是黄芩苷对牙龈卟啉单胞菌生物膜的抑制作用尚少报道，本研究探讨黄芩苷对牙龈卟啉单胞菌的抑菌效果进行体外实验，为防止牙周炎提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料 ①实验菌株为Pg ATCC33257;②主要试剂及仪器:100 mg/L黄芩苷。医用聚氯乙烯(PVC)吸痰管，截成0.6 cm长作为生物膜载体;戊二醛、无水氯化钙、硝酸银、对苯二酚、硫代硫酸钠均为国产分析纯。BHI培养基。

1.2 方法 ①体外生物膜模型建立:取培养的Pg用BHI培养基配制成1×105CFU/ml浓度菌液。24孔板每孔加入1 ml菌液和1mlBHI培养基，放入一经高压灭菌PVC片，37℃恒温静置培养5 d，每24 h更换1次培养液。光学显微镜4×10倍下观察是否有细菌生物膜附着于PVC片，设置空白PVC片作为阴性对照;②黄芩苷对 PgMIC测定:根据CLSI2009，先按2倍稀释将黄芩苷100 μl加到96孔板中，再加入1 ×105CFU/mlPg 菌液 100 μl，37℃ 恒温培养 24 h，无细菌生长孔内所 含最低抗菌药物浓度即为最低抑菌浓度(MIC);④黄芩苷对Pg生物膜的影响:将生长有Pg的PVC片置人含黄芩苷的试管中，37℃下培养，各组分别于药物作用0 h、6 h、12 h、24 h 后，重复实验，取出PVC 片，用连续稀释法用BHI琼脂平板进行活菌计数。

1.3 统计学处理 实验结果双因素方差分析。P＜0.05。

2 结果

2.1 光镜下观察牙龈卟啉单胞菌生物膜 光学显微镜4×10倍下观察，可见散落的白色絮状膜样物。细菌接种培养1 d后PVC片，无变化;培养3 d后PVC片，见散落的白色絮状物;培养5 d后PVC片，见整个视野浓厚的絮状膜样物质覆盖，呈栅栏状。

2.2 黄芩苷对Pg ATCC33257 MIC测定 黄芩苷对Pg ATCC33257的MIC为32.25 mg/L。

2.3 黄芩苷对生物膜的影响 结果显示，黄芩苷组从6 h开始活菌数开始减少。见表1。

表1 经黄芩苷作用后BF内存活细菌数的变化(102CFU/ml)

3 讨论

生物膜(Biofilm)是指细菌不可逆转地黏附在物体表面或其本身细胞之间相互黏附，并被其自身所分泌的细胞外黏质所包裹而形成的特殊结构，它的形成导致细菌的生长状态和基因表达的改变。在由细菌引起的慢性感染性疾病中，如牙周病，生物膜作为致病因子起着重要作用。由于生物膜的存在，使得膜内的细菌逃逸宿主免疫系统和抗生素的杀伤作用，导致了广泛的耐药性，成为潜在的感染源。

本实验采用细菌极易黏附的PVC吸痰管作为载体进行牙龈卟啉单胞菌生物膜的体外培养。结果显示，培养3 d后PVC片，见散落的白色絮状物;培养5 d后PVC片，白色絮状物质层次多，较致密。研究结果提示5 d后牙龈卟啉单胞菌在体外可形成成熟的生物膜。

黄芩苷具有清热解毒、抑菌抗炎、鳌合金属离子和抗肿瘤等药理作用。有研究表明黄芩苷对减轻牙周炎动物模型的牙周炎症反应，还能抑制牙周膜细胞对细菌脂多糖的炎性反应［2］。本实验发现，32.25 mg/L的黄芩苷对牙龈卟啉单胞菌生物膜有明显的抑制和破坏，提示其对牙龈卟啉单胞菌生物膜的发育有明显的破坏作用，且作用与剂量呈正比。黄芩苷对牙龈卟啉单胞菌生物膜的抑制作用可能是其抑制细菌黏附性的机制之一。我们的研究结果提示黄芩有可能为牙周炎的综合治疗提供一条新途径。

［1］邓辉，吴亚菲.牙龈卟啉单胞菌与动脉粥样硬化发病的关系.国际口腔医学杂志，2009，36(4):438-440.

［2］黄绮凌，宋宁.黄芩对小鼠实验性牙周炎血清IgG1和IgG2a水平影响的研究.中国病理生理杂志，2011，27(1):171-174.