马来酸噻吗洛尔滴眼液中羟苯乙酯含量测定方法研究

辛继跃 朱样根 危雪晖 黄志元

（江西珍视明药业有限公司，江西 抚州 344000）

马来酸噻吗洛尔是一种非选择性β肾上腺能受体阻断药，无明显的内源性拟交感活性和局麻作用，对心肌无直接抑制作用。其滴眼液对高眼压患者和正常人均有降低眼内压作用。其处方中所含的羟苯乙酯为抑菌剂，其用量过大会对眼组织产生较大的刺激，因此，我们为进一步控制本品的质量，建立了抑菌剂羟苯乙酯高效液相色谱法（High-performance Liquid Chromatography，HPLC）含量测定方法。通过方法学研究，结果该方法简便、灵敏、准确，重现性好，可用于本品羟苯乙酯的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1100型高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；ESJ180-4型电子分析天平，龙腾电子科技有限公司；7530G紫外可见分光光度计，上海分析仪器有限公司；迪马 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱。

1.2 试剂

乙腈(上海陆都化学试剂厂，色谱纯，批号：20081118)；水为二级反渗透水再经多效蒸馏水机蒸馏制得；羟苯乙酯对照品（批号：100847-200501）由中国药品生物制品检定所提供；马来酸噻吗洛尔滴眼液（批号为：070103，080501，080502，080503）由江西珍视明药业有限公司生产；阴性溶液由江西珍视明药业有限公司生产。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及测定方法

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈∶水（40∶60）为流动相；流速为1 mL/min；检测波长为254 nm；进样量为 20 μL。

取羟苯乙酯对照品适量，精密称定，用水稀释成每毫升含羟苯乙酯12 μg的溶液作为对照品溶液；精密量取样品溶液1 mL，置25 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；分别吸取对照品溶液和供试品溶液20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，计算，即得。

2.2 方法学研究

2.2.1流动相的选择参照文献[1]用流动相组成为乙腈∶水（25∶75），结果羟苯乙酯的保留时间较长(48 min左右)不利于含量测定。调整流动相的比例为乙腈∶水（40∶60），结果羟苯乙酯的保留时间为12 min左右，色谱峰分离理想，峰形良好，可满足本品羟苯乙酯含量测定的需要。

2.2.2测定波长的选择取羟苯乙酯适量，精密称定，加乙醇定量稀释成每1 mL含羟苯乙酯5 μg的溶液，在220～400 nm范围内扫描，该样品在257.4 nm波长处有最大吸收；另取羟苯乙酯适量，精密称定，加水定量稀释成每1 mL含羟苯乙酯6 μg的溶液，在220～400 nm范围内扫描，该样品分别在255.2、255.8、256.4 nm波长处有最大吸收。而文献[2]选择254 nm作为测定波长，综合考虑系统误差原因，确定254 nm波长作为检测波长。

2.2.3处方成分的干扰考察

①按处方量配制除羟苯乙酯外的溶液作为阴性溶液。

②取羟苯乙酯对照品适量，精密称定，用水稀释成每毫升含对羟基苯甲酸乙酯12 μg的溶液作为对照品溶液。

③精密量取阴性溶液1 mL，置25 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为空白供试品溶液。

取②、③项下两种溶液分别取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果表明阴性溶液对羟苯乙酯含量测定无干扰，见图1～3。

图1 阴性溶液HPLC色谱图

2.2.4线性试验精密称取羟苯乙酯对照品30.48 mg，加适量水加热溶解后，冷却，移至100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为储备液；取该储备液，分别稀释成3.048、6.096、12.192、18.288、24.384 μg/mL 的溶液，取 20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，以浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，进行线行回归得回归方程为：Y=125.417 3X－23.462 2，r=0.999 9，结果表明该法线性关系良好。结果见表1。

图2 羟苯乙酯对照溶液HPLC色谱图

图3 马来酸噻吗洛尔滴眼液中羟苯乙酯对照溶液HPLC色谱图

表1 线性试验结果

2.2.5精密度试验精密吸取按2.1测定法项下配制的对照品溶液20 μL注入液相色谱仪，连续进样5针，测定其峰面积，结果见表2。

表2 精密度试验结果（RSD=0.74%）

2.2.6重复性试验取070103批样品，按供试品制备方法制备5份供试品，依法测定，计算羟苯乙酯的含量，结果见表3。

表3 重复性试验结果（RSD=0.36%）

2.2.7耐用性试验

2.2.7.1 调柱温 分别将柱温调至20、25、30℃，然后分别测定070103批马来酸噻吗洛尔滴眼液中羟苯乙酯含量，结果见表4。

表4 不同柱温条件下羟苯乙酯含量测定结果（RSD=0.32%）

2.2.7.2 调流速 分别将流动相流速调为0.8、1.0、1.2mL/min，然后分别测定070103批马来酸噻吗洛尔滴眼液中羟苯乙酯含量，结果见表5。

表5 不同流速条件下羟苯乙酯含量测定结果（RSD=0.06%）

2.2.7.3 调流动相比例 分别将流动相比例调为乙腈∶水 =35∶65、乙腈:水 =40∶60、乙腈∶水 =45∶55，然后分别测定070103批马来酸噻吗洛尔滴眼液中羟苯乙酯含量，结果见表6。

表6 不同流动相比例条件下羟苯乙酯含量测定结果（RSD=0.21%）

综上所述，耐用性试验结果表明，在流动相比例小幅改变、柱温及流速等有所改变的情况下，羟苯乙酯色谱峰仅是出峰时间略有差异，所测得的含量无明显差异，即色谱条件的改变并不影响马来酸噻吗洛尔滴眼液中羟苯乙酯含量测定。

2.2.8待测溶液稳定性取供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、24 h 吸取 20 μL，连续进样 6 次，检测其峰面积。结果表明，供试品在24小时内稳定。

结果见表7。

表7 待测溶液稳定性试验结果

2.2.9回收率试验取处方量原辅料，加水制成处方浓度的不含羟苯乙酯的空白溶液，按80%、100%、120%比例分别加入羟苯乙酯对照，加入稀释成约9.69、12.01、14.47μg/mL的溶液各3份，精密吸取20 μL进样，计算回收率。回收率试验表明，本法回收率良好。结果见表8。

表8 回收率试验结果

综上所述，方法学研究试验结果表明，该法可以准确测定马来酸噻吗洛尔滴眼液中羟苯乙酯含量。

2.3 样品含量测定

测定常温留样36个月三批样品（批号：080501，080502，080503）羟苯乙酯含量，结果见表 9。

表9 常温留样羟苯乙酯含量测定结果

3 讨论

滴眼剂的处方工艺设计要求考虑无菌度的保持。一般滴眼剂常为多剂量给药形式，在使用过程中无法始终保持无菌，抑菌剂的加入是必要和重要的。《中国医院制剂规范》[4]指出羟苯乙酯的抑菌浓度为0.02%～0.08%，即每1 000 mL中溶入0.2 g羟苯乙酯可达到抑菌效果。表2可见，所测样品的羟苯乙酯含量均在有效抑菌浓度范围内。本公司所研制及生产的马来酸噻吗洛尔滴眼液中羟苯乙酯处方量为0.3 g(即含0.03%)，根据研究结果将马来酸噻吗洛尔滴眼液中羟苯乙酯含量范围定为：0.024%～0.036%，能够控制本品质量。

由于羟苯乙酯在水中几乎不溶，因此，在配制羟苯乙酯对照品溶液时，用适量热水溶解并冷却后再稀释至规定浓度较好。

[1]朱全刚，胡晋红，孙华君，等.3种内服液体制剂中羟苯甲酯和羟苯乙酯的含量测定[J].中国药房，2002，13(9)：553-554.

[2]吴淑婷.羟苯乙酯滴眼液质量标准的研究及其稳定性考察[J].首都医药，1998，5(7)：15.

[3]潘学田.中国医院制剂规范[M].第2版.北京：中国医药科技出版社，1995：26.

[4]国家药典委员会.中国药典2005年版(二部)[M].北京：化学工业出版社，2005：42.