脂多糖激活补体诱导内皮细胞释放黏附分子和凋亡

沈良贤，李 敏，孙黔云，石京山

(1.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州贵阳 550002;2.遵义医学院，贵州遵义 563000;3.贵州省人民医院呼吸疾病研究所，贵州贵阳 550002)

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰阴性菌细胞壁的正常结构成分，临床上又称为内毒素。在严重创伤、感染等应激状态下，大量内毒素释放入血，从而启动炎症和损伤，导致内毒素血症、全身炎症反应综合征、感染性休克和多器官功能障碍综合征等病症。LPS具有多种病理生理效应。有研究表明，LPS能够激活补体［1-2］。补体是免疫系统的重要组成部分，广泛参与机体防御反应以及免疫调节［3-4］，其过度激活在炎症反应的初始阶段起着启动、放大和效应的作用，通过抑制补体能有效减轻组织损伤程度［5］。迄今，LPS影响内皮细胞形态功能的研究颇多，但LPS激活补体对内皮细胞的作用极少见报道。为进一步了解病理生理情况下LPS激活血清补体对内皮细胞的影响，加深对相关疾病机制的认识以及为补体抑制剂的筛选评价提供参考依据，本工作开展了LPS激活补体作用于内皮细胞的相关实验研究。

1 材料与方法

1.1材料人微血管内皮细胞株HMEC由本实验室传代培养;眼镜蛇毒因子 (cobra venom factor，CVF)的制备、补体活性的测定参照文献［6-7］;LPS(Esherichia coli O111:B4)、兔抗绵羊红细胞抗体购自美国Sigma公司;SRB(Sulforhodamine B)是东京化成工业株式会社产品;Caspase-3/7试剂盒购自美国Promega公司;人 P-selectin、E-selectin和 ICAM-1 ELISA试剂盒购自武汉博士德生物有限公司;正常人血清(normal human serum，NHS)由本实验室健康志愿者献血制备而得;灭活人血清(inactivated normal human serum，INHS)由NHS经56℃处理30 min而得;其它试剂均为进口或国产分析纯。

1.2仪器Nikon TS100倒置相差显微镜(日本Nikon公司);Molecular Devices Spectra MAX-190连续波长酶标仪(美国MD公司);Forma 3111型 CO2培养箱(美国Thermo公司);5810R冷冻离心机(德国Eppendorf公司);GloMax发光检测仪(美国Promega公司)。

1.3方法

1.3.1HMEC的培养HMEC用含体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养基在37℃、5%CO2培养箱内培养，待细胞达到对数生长期进行实验。

1.3.2LPS激活血清补体的作用

1.3.2.1LPS对经典途径的激活 将不同浓度的LPS、NHS 各 15 μl混合后于 37℃ 预孵 2 h;取 LPS(400 mg· L-1)与 NHS各15 μl混合后于37℃预孵不同时间，分别取10 μl孵育混合物加入90 μl的GGVB(葡萄糖巴比妥明胶缓冲液)，再加入100 μl致敏绵羊红细胞(5 ×1011cells· L-1)，37℃孵育30 min后，加入1 ml冷生理盐水终止反应，2 000 r·min-1离心10 min，取上清于412 nm测定吸光值。

1.3.2.2LPS对替代途径的激活 将不同浓度的LPS、NHS 各24 μl混合后于 37°C 预孵 2 h;取 LPS(800 mg· L-1)与 NHS 各 24 μl混合后于 37°C 预孵不同时间，分别取40 μl孵育混合物加入60 μl的GVB(巴比妥明胶缓冲液)，再加入100 μl兔红细胞(1.5 × 1011cells· L-1)，37°C 孵育 30 min 后，加入0.5 ml冷生理盐水终止反应，2 000 r· min-1离心10 min，取上清于412 nm测定吸光值。

1.3.3LPS激活血清补体活化HMEC的条件将HMEC 以5 ×107cells· L-1接种于 96 孔板，90 μl/孔，培养48 h后加入孵育混合物(NHS体积分数为5%、10%，15%、20%、25% 和 30%)，37℃ 培养20 min;在另一组实验中加入NHS体积分数为20%的孵育混合物，37℃分别培养 5、10、20、30、60 min。取细胞上清，2 000 r· min-1离心10 min，取上清液按试剂盒说明书测定P-selectin。

1.3.4LPS激活血清补体对HMEC表达黏附分子的影响将HMEC以5×107cells· L-1接种于96孔板，90 μl/孔，培养48 h后加入血清体积分数为20%的孵育混合物，37℃培养不同时间后，取细胞上清，2 000 r· min-1离心10 min，取上清液按试剂盒说明书测定 P-selectin、E-selectin和 ICAM-1。以CVF激活血清补体作为本实验的平行对照。

1.3.5LPS激活血清补体诱导HMEC凋亡的情况HMEC以5×107cells· L-1接种于96孔板，90 μl/孔，培养48 h后加入血清体积分数为20%的孵育混合物，再培养24 h，按试剂盒说明书测Caspase-3/7活性。以CVF激活血清补体作为本实验的平行对照。

1.3.6LPS激活血清补体对HMEC生长的影响将HMEC以5×107cells· L-1接种于96孔板，90 μl/孔，培养48 h后加入血清体积分数为20%的孵育混合物，37℃培养24 h后，弃去培养基，加质量分数为 10% 的 TCA 100 μl/孔，4℃ 固定 1 h，弃去，双蒸水轻轻洗5次，加入体积分数为1%的醋酸配置的 4 g· L-1的 SRB，100 μl/孔，室温染色15 min，弃去，用体积分数为1%的醋酸洗5次，晾干，加10 mmol· L-1Tris 溶液 150 μl/孔，溶解后于 570 nm波长处测定吸光值。以CVF激活血清补体作为本实验的平行对照。

1.3.7统计学分析结果以±s表示，全部数据采用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验。

2 结果

2.1LPS激活血清补体的作用LPS在预孵条件下，能激活补体经典途径和替代途径，这种激活具有剂量和时间依赖性(Fig 1)。在预孵2 h的条件下，对经典途径和替代途径溶血的IC50分别为118.48、195.82 mg· L-1。

2.2LPS激活血清补体活化HMEC的情况LPS和NHS共同孵育后作用于HMEC，结果显示，P-selectin瞬时释放增加，呈现量效依赖性(Fig 2)。

2.3LPS激活血清补体对HMEC表达黏附分子的影响实验中LPS和NHS孵育后作用HMEC，使P-selectin瞬时释放增加，E-selectin、ICAM-1表达明显上调(Fig 3)。

Fig 1Effect of LPS on complement activation(±s，n=3)

Fig 2 Effect of incubation mixture of LPS and NHS on inducing HMEC to release P-selectin(±s，n=3).

2.4LPS激活血清补体诱导HMEC凋亡的情况

与INHS和LPS+INHS比较〔凋亡信号分别为(269 125.30±51 949.59)RLU、(273 239.20±26 454.41)RLU〕，LPS激活血清补体可导致 HMEC Caspase-3/7的活性信号明显增强［(368374.3±19187.67)RLU］(Fig 4)。值得注意的是，单独的LPS可诱导Caspase-3/7信号明显增强［(1538748±118721.20)RLU］。

2.5LPS激活血清补体对HMEC生长的影响在本实验选择的条件下，LPS激活血清补体后对内皮细胞的生长未产生明显抑制，各组之间比较，差异无统计学意义(数据未列出)。

3 讨论

脂多糖在败血症等一系列病症的发生中起重要作用，通过识别特异性细胞受体激活体内多种效应细胞，释放细胞因子、炎症介质，产生一系列病理生理效应。本实验结果显示，LPS激活补体具有量效、时效性，其激活产物能影响内皮细胞的功能，刺激P-selectin、E-selectin、ICAM-1的表达和凋亡的发生。

本研究通过LPS激活血清补体的量效、时效关系，确定了LPS激活血清补体的剂量和作用时间，在此基础上，通过测定血管内皮细胞活化重要指标P-selectin的释放情况，最终确立了LPS激活补体活化内皮细胞的合适条件。

Fig 3 Effect of incubation mixture of LPS and NHS on inducing HMEC to release P-selectin，E-selectin and ICAM-1(±s，n=3)

Fig 4 Apoptosis of HMEC induced by incubation mixture of LPS and NHS(±s，n=3).*P＜0.05 vs INHS;#P＜0.05 vs LPS+INHS

本实验显示，LPS激活血清补体能引起HMEC活化，明显表达P-selectin、E-selectin和ICAM-1。P-selectin和E-selectin是选择素家族中的重要成员，P-selectin主要分布于内皮细胞和血小板，主要介导粒细胞和单核细胞在内皮细胞表面滚动和最初结合，启动炎症的早期反应［8］。E-selectin主要分布于活化的内皮细胞，具有促进白细胞与内皮细胞黏附，向炎症部位游走的功能。ICAM-1属于免疫球蛋白超家族中的成员之一，引起炎症细胞牢固黏附并跨内皮移行至血管外，参与炎症的发生发展［9］。上述情况提示LPS激活血清补体具有促进中性粒细胞向内皮细胞黏附、聚集、游出的作用，从而启动、加重损伤部位的炎症反应。在实验中我们检测到Caspase-3/7活化明显增强的信号。Caspase家族在凋亡程序的启动和执行过程中，起着非常重要的作用，直接参与凋亡的早期启动、凋亡信号传递及凋亡晚期事件。Caspase-3/7是凋亡晚期表达的关键酶，其一旦活化，凋亡的发生就不可逆转。从实验中可以看到，CVF激活补体出现了明显的凋亡信号，说明补体激活确实能诱导凋亡，这与文献报道一致［10］。LPS与NHS孵育组和对照组(LPS+INHS)相比，凋亡信号有明显增强，说明LPS激活的补体明确诱导了凋亡。值得注意的是，单独的LPS能诱导强烈凋亡，但通过比较LPS组与LPS+INHS组以及正常细胞对照组的实验结果，表明血清几乎可以完全抑制LPS自身所能诱导的凋亡。同时，也提示由LPS本身所诱导的这种凋亡在体内血液环境下不太可能发生。

本实验采用能特异激活补体替代途径的CVF作为平行对照，考察激活血清补体对HMEC的作用和影响。CVF是来源于眼镜蛇毒的一种高效补体激活蛋白，在正常血清中可与B因子形成具有C3/C5转化酶活性的CVFBb，导致补体替代途径持续激活，产生大量C3a、C5a及攻膜复合物(membrane attack complex，MAC)。CVF作为一个常用的补体研究工具，激活补体与体内补体激活高度相似，可用于模拟机体在病理状态下补体替代途径的过度激活状态。本实验显示，LPS激活血清补体作用于内皮细胞的效应与CVF激活血清补体类似，提示LPS激活血清补体也产生了C3a、C5a和MAC。

本研究通过LPS激活补体作用内皮细胞，模拟病理生理情况下体内LPS对靶细胞的作用情况，表明LPS激活补体能活化和损伤内皮细胞，明显上调黏附分子表达，并诱导内皮细胞凋亡。本工作有助于加深对补体相关疾病机制的认识和理解，为相关临床治疗策略、新药研究提供有益的思路和参考。

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