周边γ-氨基丁酸通过GABAB受体调控骶髓后联合核神经元谷氨酸能突触

马红雨，林 凯，罗 丹，吕建晓，杨 鲲

(1.空军总医院临床检验中心，北京 100142;2.第四军医大学解剖学教研室暨梁球锯脑研究中心，陕西 西安 710032;3.美国马里兰大学生理系，巴尔地摩 21201，美国)

骶髓后联合核(sacral dorsal commissural nucleus，SDCN)位于脊髓灰质腰骶段中央管后外侧。在大鼠，SDCN出现在腰6(L6)至骶4(S4)段，是接受躯体感觉和内脏感觉初级传入的重要部分，并将初级传入信息向对侧脊髓以上核团投射［1］。谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统最重要的兴奋性神经递质。SDCN神经元接受广泛的谷氨酸能传入［1］。而γ-氨基丁酸(GABA)是中枢神经系统主要的抑制性神经活性物质。在脊髓，GABA受体分为离子型GABAA受体和代谢型GABAB受体两种［2］。在成年哺乳动物，GABAA受体被激活后，引起氯离子(Cl-)通道开放，导致胞外的Cl-内流，神经元超极化，进而抑制神经元的活动［3］。与GABAA受体等离子门控型受体不同，GABAB受体属于具有7个跨膜区段并与胞内G蛋白偶联的代谢型受体［3］。形态学研究表明［4-5］，GABAB受体在脊髓背角和SDCN均有广泛表达。在中枢神经系统和脊髓，于突触结构(突触前膜、突触后膜、突触间隙)外，存在一定水平的周边神经活性物质(ambient neuroactivities)。这些神经活性物质，可能参与突触递质释放的调节［6］。在脊髓背角和 SDCN，GABAB受体被其外源性受体激动剂激活，进而调节突触前递质释放和突触后神经元兴奋性已有很多研究［4，7-8］。但存在于突触周边的内源性GABA是否通过对谷氨酸能突触上的GABAB受体的影响，进而调节谷氨酸释放，尚不清楚。本实验拟用电生理学方法研究上述问题。

1 材料与方法

1.1标本制作实验动物为5～8周成年♂Sprague-Dawley(SD)大鼠。脊髓薄片制作方法如前所述［7，9-10］:用乌拉坦将动物腹腔注射麻醉(1.5 g·kg-1体质量)，沿背正中线由骶髓水平向上至胸髓水平剪开皮肤，以组织剪沿椎骨棘突两侧剪开肌肉，暴露横突，行椎板切除术，小心暴露脊髓。将脊髓于胸段水平横断，向下至全骶髓连同蛛网膜和软膜一并取出，迅速置于冷的人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)中。除去蛛网膜和软膜，修剪去前根和背根。振动切片机(DTK-1 000，Dosaka EM，日本)切取厚度为500 μm的腰骶部位脊髓横切薄片。将标本转移到记录槽中，ACSF液持续灌流(速度～10 ml·min-1;(36±1)℃。预孵育30 min开始记录。

1.2药品与溶液GABAB受体特异性拮抗剂3-［［［(3，4-dichlorophenyl)methyl］amino］propyl］(diethoxy-methyl)phosphinic acid(CGP52432)，河豚毒素 (tedrodotoxin，TTX)，6-cyano-7-nitroquinoxaline-2，3-dione(CNQX)，GABAA受体拮抗剂 picrotoxin和胞内G蛋白偶联受体阻断剂guanosine 5'-［β-thio］diphosphate trilithium salt(GDP-βS)均购自 Sigma公司(美国)。其他药品购自试剂公司。ACSF成分为(mmol·L-1):NaCl 117，KCl 3.6，CaCl22.5，MgCl21.2，NaH2PO41.2，NaHCO325，glucose 11，picrotoxin 0.05。记录电极细胞内液成分为(mmol·L-1):K-gluconate 135，KCl 5，CaCl20.5，MgCl22，EGTA 5，Hepes 5，Mg-ATP 3.6，GDP-βS 1。电极内液中的GDP-βS能够抑制被记录神经元(突触后神经元)胞内G蛋白，以排除突触后GABAB受体的作用［7-8］。

1.3全细胞记录与给药方式标本置于灌流槽内，以一银丝缠绕细尼龙线作成的“U”字型锚固定薄片。以“盲插法”(blind patch)形成全细胞电压钳记录，封接方法如另文详述［9］。在钳制电压为 -70 mV时，一般可以观察到自发的兴奋性突触后电流(spontaneous excitatory postsynaptic currents，sEPSCs)。当外液加入河豚毒素 (0.5 μmol·L-1)时，可记录到的微小突触后电流 (miniature EPSCs，mEPSCs)［7，9］。使用同心圆电极给予点刺激(focal stimulation)时，可直接激活突触前终末，引起兴奋性突触后电流 (evoked excitatory postsynaptic currents，eEPSCs)［11］。模式/数字信号转换系统和记录软件分别为 Digidata 1200A analog/digital interface和pClamp 6(均购自Axon Instruments)。

实验前将药物用蒸馏水或二甲基亚砜(DMSO)制成1 000～5 000倍浓度储备液。使用前，以ACSF稀释至终浓度。采用灌流方式给药，分别记录给药前(对照组)，给药后(实验组)及洗脱后的电流变化。

1.4数据处理和统计学分析实验结果用Axo-Graph 4.0(Axon Instruments)或Clamp Fit 8.0(Molecular Devices，美国)分析。数据在Stat View(Apple McIntosh，美国)或 Sigma Plot 9.0(Sigma Plot，美国)上进行计算和统计学比较。数值以±s表示。n代表实验的细胞数目。结果处理用Student’st-test(t检验)、χ2检验或 Kolmogorov-Smirnov test(K-S检验)。

2 结果

2.1抑制突触前GABAB受体导致刺激引起的兴奋性突触后电流(eEPSCs)幅度增加钳制电压为-70 mV 时，突触前刺激(100 μs，0.033 Hz)在一定强度下(3～20 V)，可诱导出稳定的兴奋性突触后电流eEPSCs。记录5 min稳定的对照电流后，灌流GABAB受体特异性受体阻断剂CGP52432(1 μmol·L-1，8 ～ 10 min)［3］。如 Fig 1A 所示，CGP52432增加eEPSCs的幅度。在所有被观察的11个神经元上，CGP52432灌流8 min增加eEPSCs的幅度至对照水平的(141±18)%(P＜0.05，pairedt-test)(Fig 1B)。CGP52432的易化作用，经洗脱后可部分恢复。

我们的既往研究表明［4，7，9］，GABAB受体特异性激动剂氯苯氨丁酸(baclofen)减少微小兴奋性突触后电流mEPSCs。本实验进一步观察到，CGP52432(1 μmol·L-1，10 ～15 min)对 mEPSCs的频率或幅度分布均无影响(K-S检验):平均频率在对照组为(3.1±1.0)Hz，CGP52432灌流后为对照数值的(107±10)%;平均幅度在对照组为(21.3±8.2)pA，CGP52432处理后为对照水平的(99±7)%(两组均为P＞0.05，t检验，n=13)(Fig 1C)。以上结果表明，以CGP52432阻断谷氨酸能突触前GABAB受体，导致eEPSCs幅度增加(即谷氨酸释放增加)，但是对自发微小突触电流无明显影响。

2.2突触前GABAB受体参与eEPSCs幅度增加为进一步确认CGP52432是否作用于突触前GABAB受体，我们选用了同心圆电极间隔刺激法:当两次刺激间隔为50 ms、频率为0.033 Hz、钳制电压为-70 mV时，可以观察到同心圆刺激电极刺激引起的配对刺激比率(paired-pulse ratio;PPR)(Fig 2A)。对照组eEPSCs的PPR(P2/P1)为(0.78±0.07)，灌流 CGP52432(1 μmol·L-1，8 ～10 min)使PPR值变为0.65±0.09，较对照值增大(P＜0.05，n=12)(Fig 2B)。提示CGP52432增加刺激引起的谷氨酸释放的作用部位是突触前GABAB受体。

2.3抑制突触前GABAB受体导致沉默突触功能恢复上述结果表明，阻断突触前GABAB受体可增加谷氨酸释放，本实验进而研究该效应是否可以将谷氨酸能的沉默突触(silent synapse)变成活跃突触(active synapse)。我们首先寻找沉默突触。方法如前所示［12］:以同心圆电极进行双刺激(间隔为50 ms)，在一定强度下，可找到第1个刺激冲动诱发eEPSCs;逐渐降低刺激强度，一般在阈强度90%左右，可找到符合下列标准的沉默突触:①第1个eEPSCs至少连续20次刺激经目视检查，无可分辨的幅度(沉默突触);② 第2个eEPSCs偶然出现。此种类型沉默突触一般认为是因为第1个刺激引起的递质释放不足而引起的“突触前沉默”［12］。如Fig 3A所示，沉默突触在灌流CGP52432后部分恢复功能成为活跃突触 (active synapse)。CGP52432引起第1个突触的平均幅度和诱发eEPSCs成功率均有明显增高(Fig 3B)。在13个被检测的“突触前沉默”的神经元中，CGP52432灌流8 min后，11例转变为活跃突触(P＜0.05，χ2检验)。

Fig 1 Evoked excitatory postsynaptic currents in SDCN neuron enhanced by blockade of GABABreceptors by CGP52432

3 讨论

本研究通过用药理学方法先阻断突触后SDCN神经元 GABAB受体，排除突触后作用后，再以CGP52432阻断位于谷氨酸能突触前的GABAB受体，观察到刺激引起的谷氨酸释放增加，且此易化作用发生在突触前。结果提示，在SDCN，突触周边存在的GABA通过GABAB受体，对谷氨酸释放起限制作用。

Fig 2 Paired-pulse ratio decreased by CGP52432.

大部分神经递质在神经元胞体合成后，运输至突触前末梢，参与递质释放。被释放的递质部分与突触后膜上的受体结合，部分经过重摄取(re-uptake)再次进入突触前膜，还有部分溢出(spillover)突触结构，成为周边神经活性物质。分布在突触周边存在的抑制性神经活性物质对突触起着紧张性调节(tonic modulation)作用。周边GABA的来源，至少有两个:除上述的溢出外，最新研究表明胶质细胞也可能释放GABA［13］。本研究中，尚不能判断周边GABA的具体来源。

Fig 3 A presynaptic silent neuron becoming active to application of CGP52432

经典神经电生理学通过对PPR的分析，可以判定某种特定药物的作用部位(突触前或突触后)。在PPR实验中，由于两次刺激间隔的时间短，实施第2次刺激时，突触前已经流入的Ca2+还处于较正常为高的水平，影响第2次刺激引起的Ca2+内流，因而第2次刺激引起的变化小。给予某种药物时，如果对第1次刺激的相对作用大于对第2次刺激的相对作用，则可以判断为突触前作用。本实验中，CGP52432明显降低PPR的比率，因而推断增加谷氨酸释放的作用位点为突触前GABAB受体。令人感兴趣的是，CGP52432阻断GABAB受体，却对静息条件下的微小突触电流(mEPSCs)没有影响(Fig 1C)，提示上述的调节作用只存在于突触前动作电位诱发的谷氨酸释放。

需要指出的是，脊髓SDCN神经元的突触前和突触 后 均 有 GABAB受 体 分 布［4-5］，因 而 用CGP52432可能对突触前后的GABAB受体后都产生作用。在本实验中，突触后GABAB受体的作用被通过记录电极施与的 GDP-βS 阻断［4，8，11］，因而可以排除GABAB受体的突触后作用。

SDCN接受广泛的初级传入，其中部分传入介导伤害性躯体感觉与内脏感觉信息。这些信息经过SDCN，由投射神经元再进一步向延髓和丘脑等目标核团投射［1］。本研究中发现的周边 GABA通过GABAB受体影响谷氨酸的释放，很可能参与这种伤害性信息传递的调制。GABAB受体在影响突触前兴奋性谷氨酸释放的同时，也能调节抑制性神经递质，如GABA自身和甘氨酸(glycine)的释放(杨鲲等，待发表资料)。而抑制性递质释放的减少被认为对突触后神经元有间接的兴奋作用，因而周边GABA对SDCN信息传递调节的具体机制，对信息加工的“净作用”(net effect)，尚需进一步研究确认。

脊髓作为伤害性信息传递与调控的第一站，有许多位点和可作为镇痛药的靶位。最近的研究表明，蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)参与脊髓水平炎性疼痛的表达［14］。因而，影响PKC的药物，可能有潜在的药理学价值。N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体NR2B亚型也有类似的作用［15］。长期以来，GABAB受体作为新型药物开发的热点，主要集中在如何开发其配体(激动剂及变构体)［2-3］。本研究观察到，内源性周边GABA作用于谷氨酸能突触上的GABAB受体，且只参与动作电位(突触前刺激)引起谷氨酸释放调节，对开发新型镇痛药物将有重要的参考价值。

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