正交设计优化山茱萸总苷的微波提取工艺

喻苏青,陈 凯,娄家豪,宋必卫,齐敏友

(浙江工业大学药学院,浙江 杭州 310032)

山茱萸系山茱萸科植物Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果实,始载于《神农本草经》,有良好的温肾壮阳之功,《药性论》载:“补肾气,兴阳道,坚阴茎,添精髓”.山茱萸总苷是山茱萸主要活性成分之一,可降低链脲佐菌素(STZ)所致糖尿病大鼠肌浆网钙泵(SERCA2a)的表达[1];显著降低大鼠血糖、糖化血清蛋白,提高肝糖原含量[2]等.山茱萸总苷的提取方法很多,如索氏提取法、超声提取法[3]、超临界流体萃取法[4]等.自Ganzler首次将微波辅助技术(microwave-assisted extraction,MAE)应用于植物样品提取,MAE技术[5-6]日趋成熟.笔者就该项技术应用于山茱萸总苷的微波提取工艺进行研究,并以熊果酸为标示量[7],HPLC法测定其含量.本实验提高了山茱萸总苷的提取率,建立了山茱萸总苷的微波辅助萃取工艺,操作简单,生产成本降低,有利于山茱萸的开发利用.

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

岛津LC-10A高效液相色谱仪(日本岛津).万能粉碎机(广州市大祥电子机械设备有限公司).电子分析天平(Mettler Toledo公司).格兰仕微波炉(格兰仕公司).RE52CS旋转蒸发仪(上海亚荣仪器厂).熊果酸对照品(购自中国药品生物制品检定所);山茱萸药材(购自胡庆余堂);甲醇为色谱纯;水为重蒸水;其他试剂均为分析纯.

1.2 山茱萸总苷含量的HPLC测定

1.2.1 色谱条件

色谱柱为Kromasil-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μ m),流动相为 V(甲醇)∶V(水)=9∶1;流速1.0 mL/min,柱温25 ℃,检测波长215 nm,进样量20 μL.

1.2.2 样品的处理

山茱萸60℃恒温干燥,粉碎,过60目筛,用烘箱烘至恒重保存.精密称定样品约3 g于250 mL锥形瓶中,分别按设定的微波提取条件安排实验,抽滤,滤液55℃减压浓缩得浸膏.浸膏溶于50 mL纯化水,以石油醚(60～90℃)1倍量萃取 2次,再以1倍量水饱和正丁醇萃取3次,合并正丁醇萃取液,减压浓缩至无醇味,备用.

1.2.3 标准曲线的制备

精密称取干燥至恒重的熊果酸标准品3.1 mg,用流动相定容至5 mL量瓶中,即得620 μg/mL的对照品溶液.分别取5,10,15,20,25 μL的对照品溶液进样,按上述色谱条件进行测定,测得峰面积.以熊果酸量(μg)为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程:Y=338 883X+16 393(r=0.999 8).结果显示 ,熊果酸在 3.10 ～ 15.50 μg 范围内与峰面积呈良好线性关系.

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将同一熊果酸对照品溶液,连续重复进样6次,每次20 μL,记录峰面积.熊果酸峰面积 RSD%为1.1%(n=6),结果显示仪器的精密度良好.

1.3.5 光波组合对山茱萸总苷提取率的影响

1)EL1262带超采样功能的数字量输入模块用于采集编码器同步脉冲，采样速度快，能够满足卷烟机生产速度要求；

精密称定约20 mg浸膏,用流动相定容至10 mL,摇匀,用0.45 μ m微孔滤膜过滤,取续滤液进样,按外标法测定.色谱图见图1.

图1 溶液的色谱图Fig.1 Chromatograms of control solution(a)and sample solution(b)

1.3 微波提取的单因素实验

由于微波功率主要影响升温速度,功率越大提取时环境温度升高越快,提取效率也会相对地越高.但功率越大有机试剂也越容易沸腾,不易控制,所以选取320 W条件试验.

由图5可知:山茱萸总苷的含量随着微波时间的增加而明显升高,55%微波和45%光波时间组合时达最高值.所以选择55%为最适微波光波时间比.

最近几年来，湖北省把鄂州市当作全省城乡一体化的试点市区来进行建设。鄂州市也充分利用了这次试点的机会，将构建和谐社区作为建设的重点，在和谐社区建设方面取得了长足的发展，受到了湖北省委、省政府的高度赞扬。[2]然而，鄂州市在和谐社区建设中物业管理方面仍存在一些问题，需要解决。

1.2.4 精密度测试

在提取时间分别为30,40,50,60,120,180,240 s,液固比为 25 mL/g,在功率为320 W 条件下,以95%乙醇微波提取,测定并计算提取率,见图2.

图2 时间对收率的影响Fig.2 Duration of microwave radiation

由图2可以看出:在提取时间为30～60 s时,提取率随时间的延长而逐渐升高,在60 s以后基本趋于平衡.可能是因为所含皂苷已基本溶出,所以增加提取时间不能使提取率升高.所以选取提取时间为60 s.

1.3.2 不同溶剂对山茱萸总苷提取率的影响

1)靶板成坑的体积Vc与弹丸的动能Ep近似成比例关系，即,Vc≈KEp，其中K为常数，依赖于弹-靶材料的性质。

分别以 95%乙醇、丙酮、氯仿、正丁醇、乙酸乙酯为提取液,液固比为 25 mL/g,320 W功率下微波提取60 s,测定并计算提取率,见表1.

表1 溶剂对收率的影响Table 1 Selection of solvents

由表1可知:95%乙醇和正丁醇部分皂苷收率较高.但是,正丁醇为毒性溶剂,而且沸点高,所以选择相对安全而又低沸点的95%乙醇为提取溶剂.

根据给排水、消防、电气等工艺专业的需求，配电装置楼的某些部位墙体需要安装设备箱，通常是消火栓箱、配电箱、控制箱等，消火栓箱常见最大尺寸为1 600 mm(高)×700 mm(宽)×240 mm(厚)，配电箱常见尺寸有450 mm(宽)×550 mm(高)×190 mm(深)。前文所述墙体较薄，在厚度上不能满足箱体安装要求，如果箱体局部突出墙体，既不美观又存在安全隐患，所以，安装有箱体的隔墙优化设计为双排龙骨，将箱体内嵌于墙体中间。箱体安装处往往埋管密集，经细化设计后，墙体即可满足箱体安装要求，又可在双排龙骨空隙中埋管，也避免了埋管过多对单层龙骨整体性的破坏。

1.3.4 液固比对山茱萸总苷提取率的影响

在乙醇体积分数分别为30%,50%,70%,80%,95%,99%,液固比为25 mL/g,提取时间为1 min的条件下进行微波提取,测定并计算提取率,见图3.

当收货员收完货贴好标签后，进行转运环节。这一过程是叉车司机按照系统所给的信息将货物放入相对应的货槽中。但在中途会发生一些错失，如：将货物放在相邻的位置，而不是正确的货槽里；标签有所遗失，导致该货物成为无信息货物，无法第一时间放入正确的货槽中。

图3 乙醇体积分数对收率的影响Fig.3 Concentration of ethanol

5、加强田间管理：大豆发生根腐病，主要是根的外表皮（切皮部）完全腐烂，影响对水分、养分的吸收。因此，及时趟地培土到子叶节能使子叶下部长出新根，使新根迅速吸收水分和养分，缓解病情，这是治疗大豆根腐病的一项有效农业措施。

1.3.3 乙醇体积分数对山茱萸总苷提取率的影响

由图3可知:山茱萸总苷的含量随着乙醇体积分数的升高而逐步上升.由于无水乙醇价格相对较高,为了节约成本,选择95%乙醇为提取溶剂.

因溶剂太少无法浸没物料,所以选择在料液比为10,15,20,25,30 mL/g,乙醇体积分数为95%,功率为320 W,提取时间为60 s的条件下进行提取,测定并计算提取率,见图4.

图4 液固比对收率的影响Fig.4 Solvent to material ratio

由图4可知:总苷收率随着液固比的增加而升高,当超过20 mL/g时,收率明显下降.因此选取20 mL/g为最佳液固比.

1.2.5 样品的测定

在功率为320 W,20 mL/g的95%乙醇,微波光波时间比值分别为100∶0,55∶45,30∶70,0∶100的条件下,提取1 min,测定并计算提取率,见图5.

图5 微波与光波的时间比值对收率的影响Fig.5 Light/wave time ratio

1.3.1 微波萃取时间对山茱萸总苷提取率的影响

1.4 正交试验优化微波提取工艺

在微波单因素试验的基础上,对影响山茱萸总苷提取率的主要因素乙醇体积分数、料液比、微波提取时间以及微波光波时间比值进行L9(34)正交实验,设计见表2,结果见表3.

表2 正交实验的因素水平表Table 2 Factors and levels

表3 正交试验结果Table 3 Results of L9(34)orthogonal test

由表4可知:采用微波提取法提取山茱萸总苷,液固比和时间对提取率有显著影响,光波比和乙醇体积分数没有显著性.根据极差R值可以得出,4个因素对山茱萸总苷提取率影响的主次顺序为C＞A＞D＞B,最优水平为 C3A1D2B2,即液固比25 mL/g,50 s,55%光波组合,70%乙醇.通过试验证实在该条件下总苷提取率为3.02 mg/g.

表4 正交试验方差分析表Table 4 Analysis of variance about total extraction rate

1.4 最佳条件下的重复性和回收率实验

1.4.1 重复性实验

我盯着手里的武器，在我的人生中，从没有料到会握着一把枪，更别说射击了。我感觉这很危险，好像只是碰着它，就可能随时走火伤及他人。

文道、技道关系决定作品价值和作者人生境界的高下，这是陆游否定晚唐诗的根本理论依据；而指晚唐诗“(诗格)卑弱”，也正是责晚唐诗人人格的卑弱。实际上都未出儒家正统诗学观的范围。他在《答陆伯政上舍书》中曾说：“古声不作久矣！所谓诗者，遂成小技；诗果可谓之小技乎？学不通天人，行不能无愧于俯仰，果可言诗乎？”〔1〕74陆游也认为：“大抵诗欲工，而工亦非诗之极也。锻炼之久，乃失本旨；斲削之甚，反伤正气。”〔1〕244这也是他否定晚唐诗的诗学理由。亦基于此，他才会说“亦莫雕肝肺，吟哦学郊岛”(《晨起》)，“晚唐诸人战虽鏖，眼暗头白真徒劳”(《记梦》)！

取同一批次的山茱萸样品5份,在最佳条件下进行萃取,分别测定各自的总苷含量,结果表明其相对标准偏差为1.68%.

1.4.2 加样回收率实验

收到U盘的程瀚大为光火，立即指示市公安局副局长张某不办立案手续、直接动用技侦手段追查此事。令人咋舌的是，负责处理这个案件的一名女警就是视频中的“女主角”。

准确称取一定量样品9份,加入不同量的熊果酸对照品溶液,在最佳条件下进行萃取,萃取物按试验方法进行显示,测定峰面积,计算回收率.结果表明回收率在99%～102%之间,说明此方法有较好的准确度.

1.5 微波法与传统提取方法的比较

本实验用乙醇浸提法和超声波萃取法进行对比实验.乙醇浸提法:液固比25 mL/g,95%乙醇磁力搅拌下浸泡48 h,过滤,取滤液,连续提取3次,合并滤液,减压浓缩.共萃取3次,计算平均提取率.超声波辅助提取法:液固比30 mL/g,95%乙醇,45 kHz频率,超声萃取15 min.共萃取3次,得平均提取率.以上各种萃取方法结果对比列于表5中,可以看出,微波提取法仅用1 min却比乙醇浸提48 h的提取率高.从节能、省时和试剂节约等多方面角度看,微波法优于乙醇浸提法和超声波萃取法.

表5 与其它提取方法的比较Table 5 Comparison of MAE with other extraction methods

2 结 论

主要对微波辅助法萃取山茱萸总苷进行了初步研究,正交试验表明:影响山茱萸总苷提取率的主要因素为液固比和时间.在功率300 W条件下,最佳提取工艺条件:液固比 25 mL/g,提取时间50 s,微波光波时间比值55%,乙醇体积分数70%,该条件下总苷提取率为3.02 mg/g.由重现性实验和加样回收实验的结果可以看出,建立的萃取和测定方法可靠、准确及简便.微波辅助萃取与乙醇浸提法的比较表明:微波辅助法具有快捷、高效和节能等特点,说明工艺可行.

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