超临界色谱拆分6种唑类手性农药

冯硕立,徐明仙,高伟亮,林春绵

(1.浙江工业大学 生物与环境工程学院,浙江 杭州 310032;2.杭州职业技术学院 化工系,浙江 杭州 310018)

手性异构体(对映体)的存在是自然界的一种普遍现象,在现有的农药品种中,分子中含有手性原子的化合物越来越多,据文献报道,市场上出售的农药化学品中约有30%～40%是具有手性的[1].目前主要的手性农药有:有机磷类杀虫剂,拟除虫菊酯类杀虫剂,三唑类杀菌剂,酰基氨基丙酸类杀菌剂等.手性农药对映体在生物环境中所表现出的药效学和药代动力学存在很大的差异,例如三唑醇的4个光学异构体杀菌能力完全不同,左旋体的药效高于右旋体,毒性还比右旋体低.由于单一对映体农药具有高效低毒等特点,使其在市场上的需求得到迅猛增长,利用对映体活性的不同进行新的农药的开发具有广阔的前景.目前,获得单一对映体的技术主要有对映体选择性合成与对映体分离.对映体选择合成技术上困难很大且成本太高,因此手性农药对映体分离技术日益引起人们的关注[2-4].目前,HPLC,SFC等在手性对映体分离领域中均发挥着重要作用.其中,HPLC使用很普遍,又有大量的手性固定相(CSPs)可供选择,是最常用的色谱分离技术.但是HPLC也存在分析时间过长,分离效率不高等缺陷,而SFC(一种流动相温度、压力均高于或略低于临界点的色谱技术)与常规的HPLC相比,具有体系的粘度低、扩散和传质速率高等优点,引起了许多学者的浓厚兴趣.他们对 HPLC和SFC做了一些对比研究[5,6],发现SFC的分离效率更高、分析时间更短,可以有效地弥补HPLC的不足.

三唑类农药作为一类高效杀菌剂,能有效保护谷物、大豆、水果等农作物免受细菌侵害,在农业生产中的应用非常广泛[7].三唑类农药大多拥有手性,这对它们的生物活性产生了很大的影响.目前,人们使用HPLC拆分了很多三唑类农药,使用的手性固定相有多糖类、环糊精类、大环抗生素类手性固定相[8-10],但使用SFC拆分三唑类农药的文献却很少.本实验采用SFC在Chiralpak IB手性柱上拆分了三唑酮、戊唑醇、己唑醇、烯效唑、腈菌唑、恶醚唑6种三唑类农药,并分别考察了甲醇、乙醇、异丙醇三种醇类改性剂对手性分离结果的影响.

1 材料与方法

1.1 药剂和试剂

三唑类农药(图 1):腈菌唑、三唑酮、己唑醇、戊唑醇、烯效唑和恶醚唑.所有农药纯度大于95%,溶解在乙醇中(由温州一帆化工有限公司提供).

图1 6种三唑类农药的结构式Fig.1 Structure of the six triazole fungicides

醇类改性剂:色谱甲醇、乙醇及异丙醇(天津四友).

液态CO2:干冰级CO2(杭州今工特种气体有限公司).

1.2 实验设备

超临界色谱型号为Thar SD-ASFC-2 system,配有UV/VIS-151紫外检测器和Rheodyne 7410手动进样阀(以上设备购自Thar Technologies,Pittsburgh,PA,USA).SFC系统控制软件:superchrom software.

手性色谱柱:Chiralpak IB(250 mm×4.6 mm ID,5 μ m);手性选择基团:键合在硅胶上的纤维素-(3.5-二甲基苯基氨基甲酸酯).

1.3 色谱条件和色谱参数计算

流动相主体为超临界CO2,改性剂有:甲醇、乙醇、异丙醇.流动相流速:2.0 mL/min.SFC系统温度:36℃.紫外检测波长:230 nm.

色谱柱死体积(t0)用1,3,5-三叔丁基苯(tributylbenzene)测定:1.9 min.第一个洗脱峰的保留因子:k′1=(t1-t0)/t0,第二个洗脱峰的保留因子:k′2=(t2-t0)/t0.分离度:Rs=(t2-t1)/(W1+W2).其中t1和t2分别为第一个洗脱峰和第二个洗脱峰的保留时间;W1和W2分别是第一个洗脱峰和第二个洗脱峰的半峰宽.

2 结果与讨论

如图1所示,6种三唑类农药都拥有氯苯基和1,2,4-三唑基团,除了恶醚唑有两个手性中心,4个对映体外,其他5种农药都只有1个手性中心,2个对映异构体.考虑到6种农药结构上具有一定的相似性,我们尝试用一根手性柱(Chiralpak IB)在SFC上拆分这6种农药.

2.1 醇类改性剂的影响

由表1,2可知,除了恶醚唑,其他5种农药的拆分效果都比较理想,保留时间小于10 min,分离度大于1.当醇类改性剂由异丙醇变为甲醇时,由于流动相极性增强,农药的保留时间缩短.而提高醇类改性剂的比例,也会增强流动相的极性,农药的保留变弱,同时还会降低对映体的分离度.使用同一种流动相组合,6种农药的保留时间各不相同,由长到短依次为戊唑醇、恶醚唑、腈菌唑、己唑醇、烯效唑和三唑酮.其中己唑醇和烯效唑的分子结构非常相似,保留时间也很接近.可能是由于两种农药分子中苯环上氯原子取代个数的不同造成了两者保留时间的微小差别.

表1 腈菌唑、三唑酮和己唑醇的拆分结果Table 1 Separation results of myclobutanil,triadimefon,hexaconazole

表2 戊唑醇、烯效唑和恶醚唑的分离结果Table 2 Separation results of tebuconazole,uniconazole,difenoconazole

己唑醇和腈菌唑的拆分效果最为理想,使用改性剂甲醇、乙醇或异丙醇都能使它们的对映体实现基线分离,在高浓度的改性剂条件下也能获得很高的分离度.尤其是腈菌唑,当甲醇的浓度提高到20%时,分离度仍然有6.71,因此,在拆分这两种农药时,可以使用高浓度的改性剂以缩短其保留时间.两种农药的最佳拆分条件分别为V(CO2)∶V(乙醇)=4∶1和 V(CO2)∶V(甲醇)=4∶1.

使用CO2和乙醇的流动相组合可以顺利拆开烯效唑和戊唑醇两种农药,但却不是最理想的选择.以5%的甲醇作为改性剂,可以在10分钟内基线分离烯效唑的两个对映体,分离度为2.3.用V(CO2)∶V(异丙醇)=9∶1的流动相组合拆分戊唑醇,分离度也可达到1.85.值得一提的是,甲醇适合于拆分烯效唑,但却无法拆开戊唑醇.而异丙醇正好相反.

三唑酮的两个对映体在固定相上的保留能力非常接近,将乙醇和异丙醇作为改性剂时,对映体分离度几乎为0.最后,采用5%的甲醇基本实现了其两个对映体的分离,分离度为1.06.

在HPLC上,恶醚唑的两组对映体在Chiralcel OD上始终无法得到有效分离[11],周颖等在Chiralcel OJ柱上,使用V(正己烷)∶V(乙醇)=9∶1的流动相分离了该农药的四个对映体[12].我们使用SFC,在Chiralpak IB柱上考察了三种醇类改性剂的拆分效果,三种改性剂都能拆开恶醚唑的第一组对映体,但只有乙醇才能拆开其第二组对映体.在3%到18%的改性剂比例区间内,我们考察了乙醇对手性分离的影响,发现了一个重要的现象:随着乙醇浓度的升高,第二组对映体的分离度先增加后减小,在乙醇浓度为10%时分离度达到最大值.V(CO2)∶V(乙醇)=9∶1的流动相组合即为恶醚唑的最佳拆分条件.

2.2 手性拆分机理的探讨

手性化合物在手性固定相上的拆分机理尚未被彻底阐明,对映体与手性固定相间存在着偶极-偶极、氢键-氢键、π-π作用和非手性作用(空间位阻作用)等作用力[13].对映异构体与固定相发生作用时彼此会有差异,正是这由于三唑类农药与手性固定相之间的作用非常复杂,我们在这里仅仅对其手性识别作用的可能性进行初步探讨.首先,三唑酮分子中的羰基(C=O)可以和手性固定相中的羰基(C=O)形成偶极-偶极作用,也可与固定相中的NH基团形成氢键作用.己唑醇、戊唑醇、烯效唑分子中的羟基(OH)也能与固定相中的羰基(C=O)形成氢键作用.6种农药中的苯环都能与固定相中的芳香环形成π-π共轭作用.农药苯环上的氯原子具有很强的负电性,很可能会影响发生在固定相(NH基团)上的氢键作用.在农药分子在与固定相发生化学键作用的同时,也可能受到固定相手性空腔的影响.

3 结 论

使用 SFC,以SC-CO2为流动相,以甲醇、乙醇或异丙醇为流动相改性剂,实验研究了6种唑类杀菌剂的手性分离.除了恶醚唑外,其他5种农药的手性对映体都获得了有效拆分;流动相改性剂的加入比例和种类都会对拆分结果产生影响;乙醇适合于拆分己唑醇、恶醚唑,甲醇适合拆分戊唑醇、三唑酮、腈菌唑,异丙醇则适合于分离烯效唑.通过实验和比较分析,最终得到了最佳拆分条件.

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