HPLC-ELSD法测定希明婷片中27-脱氧升麻亭的含量

2011-05-26程屹俊梁琼麟王义明由春娜罗国安

中成药 2011年1期

陈丽，程屹俊，梁琼麟，王义明，由春娜，董敏，罗国安，3*

(江西中医学院药学系，江西南昌 330004;2.清华大学中药现代化研究中心，北京 100084;3.华东理工大学中药现代化工程中心，上海 200237;4.北京北大维信生物科技有限公司，北京 100080;5.山东绿叶制药有限公司，山东烟台 264003)

希明婷片是由升麻总皂苷经辅料加工而成，主要用于女性围绝经期综合征，改善烘热汗出，烦躁易怒等症状［1-2］。文献报道升麻中三萜皂苷具有调节内分泌的作用［3］，Erdal Bedir和Ikhlas A.Khan从升麻中分离出27-脱氧升麻亭［4］。故本实验选择以三萜皂苷中的27-脱氧升麻亭为指标成分控制希明婷片的质量。

目前，紫外检测器(UVD)、示差折光检测器(RID)、蒸发光散射检测器(ELSD)、质谱检测器(MSD)是检测中药成分质量常用的4种检测器，其中紫外检测器只能用于有紫外吸收的物质的分析，其余3种检测器均为通用型检测器，可用于未知物、糖类、脂肪烃、其他无紫外吸收物质等的分析。3种通用型检测器中，RID和ELSD与MSD相比，因价格更便宜，应用相对更广。27-脱氧升麻亭为无紫外吸收物质，可采用常用的通用型检测器(RID、ELSD、MSD)进行检测，因MSD昂贵，不宜采用。文献［5］中有报道采用示差折光检测器测定升麻药材中27-脱氧升麻亭的质量，但未曾见采用蒸发光散射检测器法测定。本实验建立了采用HPLC-ELSD法测定希明婷片中27-脱氧升麻亭的含量的方法，并比较了ELSD和RID两种检测器对测定27-脱氧升麻亭的影响。

1 材料和试药

0.45 μm微孔滤膜;资生堂 MG C18柱;乙腈(色谱纯，fisher公司)，超纯水(Milli Q Synthesis超纯水纯化系统制，过0.2 μm微孔滤膜)。无水甲醇(分析纯，北京化工厂生产);27-脱氧升麻亭标准品(山东绿叶制药有限公司提供);希明婷片(山东绿叶制药有限公司，批号:20070329、20071143、20081234、20090742)。

BS110S电子天平(d=0.1 mg，赛多利斯公司);XP205型电子天平(d=0.01 mg，梅特勒托利多公司);Agilent 1200系列高效液相色谱仪(配备Alltech N2000蒸发光散射检测器，N2000色谱数据工作站);KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，功率500 W，频率 40 KHz);MilliQSynthesis超纯水纯化系统。

2 方法与结果

2.1 色谱条件资生堂MG C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相:水-乙腈梯度洗脱(见表1)，流速:1 mL/min，柱温:30℃，气体(氮气)流速:2.9 L/min，漂移管温度:115℃。对照品溶液和供试品溶液各20 μL。理论塔板数以27-脱氧升麻亭峰计不低于5 000。结果见图1～2。

表1 梯度条件

2.2 希明婷片供试品溶液的制备取10片希明婷片，研细后，取200 mg希明婷片粉末，精密称定。置25 mL量瓶中，量取20 mL甲醇，超声溶解30 min后，甲醇定容至刻度。过0.45 μm微孔滤膜，所得滤液即为供试品溶液。

2.3 对照品溶液的制备称取对照品27-脱氧升麻亭6.70 mg，甲醇溶解，定容至10 mL量瓶中，得对照品溶液。

图1 27-脱氧升麻亭的HPLC-ELSD图谱

图2 希明婷片的HPLC-ELSD图谱

2.4 线性关系考察分别精密量取1.5、1.25、0.75、0.45、0.25 mL的对照品溶液至2 mL量瓶中，甲醇稀释定容，即得6个不同浓度的对照品溶液。按2.1项下的色谱条件测定，以对照品进样量的对数值为横坐标，以峰面积值的对数值为纵坐标，进行回归，标准曲线为:Y=1.445 4X+4.961，r2=0.999 7，其线性范围为1.67 ～13.40 μg。

2.5 最低检测限及定量限试验采用信噪比法检测27-脱氧升麻亭的检出限及定量限。以信噪比为3:1时相应浓度确定其检测限，以信噪比大于或等于10:1且能准确定量时的相应浓度确定其定量限。

将27-脱氧升麻亭对照品溶液稀释一定倍数，进样20 μL，得到27-脱氧升麻亭的检出限及定量限，检测限为:0.100 μg，定量限为:0.904 μg。

2.6 精密度实验取1个27-脱氧升麻亭对照品溶液分别连续进样6次及6日内每日进样一次，分别计算6次所测的组分峰面积及相对标准偏差(RSD%)，日内精密度的RSD为4.18%，日间精密度的RSD为4.71%。结果表明该仪器精密度良好。

2.7 稳定性实验取同一份供试品溶液，分别于0、3、6、20、22、24 h不同时间间隔点进样分析，对峰面积进行考察，峰面积的RSD为3.43%。结果显示样品溶液至少在24 h稳定。

2.8 重复性实验取同一批希明婷片(批号20090742，每片的平均重量为101.93 mg)，按供试品溶液制备方法制备6份，每份样品进样2针，每针进样量20 μL。以分别计算27-脱氧升麻亭的含量(外标两点对数方程计算)及RSD(%)，结果其平均含量为2.61%，RSD为4.94%，表明该方法重现性良好。

2.9 加样回收率实验取同一批希明婷片(批号:20090742)，按2.2项供试品溶液的制备方法，平行制备9份样品，每 3份样品分别加入高(120%)、中(100%)、低(80%)3个不同每个样品按照2.1项色谱条件，分别测定其色谱图，计算其27-脱氧升麻亭的加样回收率，结果表明平均加样回收率为102.20%，RSD为2.68%(n=9)，说明该方法准确度良好(见表2)。

表2 27-脱氧升麻亭的加样回收率实验结果

2.10 样品测定取3批希明婷片，按2.2项供试品溶液制备方法制备。按2.1项下的色谱条件分析对照品溶液和供试品溶液，每批希明婷片重复测定3次，按外标法计算各样品中27-脱氧升麻亭的含量，结果见表3。

表3 样品含量测定结果(n=3)

3 讨论

3.1 供试品溶液的制备采用不同浓度的甲醇溶解升麻总皂苷提取物，结果发现，升麻总皂苷提取物在甲醇中溶解最好。此外，采用甲醇超声溶解希明婷片粉末10 min、20 min、30 min、45 min，发现甲醇超声溶解30 min后，升麻总皂苷即提取完全。

3.2 检测器的选择本研究预实验比较了RID和ELSD在相同色谱条件下(等度洗脱:乙腈-水=40:60)分析样品时所得色谱图，见图3和图4。结果显示，ELSD所得图谱基线更稳定、噪音干扰更小;而且，ELSD的检测没有流动相的限制且可以梯度洗脱，因而本实验采用ELSD作为27-脱氧升麻亭含量测定的检测器。

3.3 洗脱梯度及色谱柱的选择采用不同等度洗脱和梯度洗脱条件分析样品时，等度洗脱虽然分析时间短，但27-脱氧升麻亭和相邻峰的分离情况对色谱柱的耐用性差，故最终确定表1中所列洗脱梯度为最终洗脱梯度。在该洗脱梯度下，27脱氧升麻亭的峰形和分离度都较好，且采用Agilent C18柱、Phenomenex C18柱、Agela C18柱等色谱柱在相同色谱条件下分析样品时27-脱氧升麻亭均获得较好的分离。且样品溶液中其它色谱峰的峰形和分离度也较好，为希明婷片其它成分的定量提供参考方法。