正交试验法优选加减玉女煎的提取工艺

李 祥， 陈长勋， 郑 冰

(上海中医药大学药理教研室，上海 201203)

*通讯作者:陈长勋，男，教授。Tel:(021)51322200 E－mail:cxchen6@126.com。

加减玉女煎出自清代温病大家吴瑭的《温病条辨》，由生石膏、知母、玄参、细生地、麦冬五味药物组成。方以甘寒药物为主，清气生津与凉营养阴并施，具有清热凉血，养阴增液功效。

玄参、知母是方中两味主要中药，玄参中含环烯醚萜类成分哈巴苷和哈巴俄苷;知母含知母皂苷，属甾体皂苷，两类成分均溶于水。为了探讨和优化加减玉女煎最佳提取工艺，本文以水为溶媒，以干膏得率、玄参中哈巴俄苷(HAR)和知母中菝葜皂苷元(SAR)的煎出率为指标，采用正交试验设计优选加减玉女煎最佳提取工艺。

1 仪器与试药

Agilent1100型高效液相色谱仪;2000ES型蒸发光散射检测器(Alltech);Aglient1200型高效液相色谱仪(Agilent 1200系列四元泵，Agilent 1200可变波长检测器，Agilent工作站);HH－4恒温水浴锅(江苏金坛市杰瑞尔电器);KUDOS－SK7200LH超声仪(上海科导超声仪器);FA－2004N 型电子天平、德国SartoriusCP225D型电子天平(上海中医药大学科学技术实验中心)。

知母(购于上海市养和堂饮片厂，批号:090209);生地(上海市养和堂饮片厂，批号:090109);玄参(上海市康桥饮片有限公司，批号:090120);麦冬(购于上海市康桥饮片有限公司，批号:090114);石膏(购于上海市康桥饮片有限公司，批号:081205)。上述药材，经上海中医药大学生药学教研室赵志礼教授鉴定均为正品。

哈巴俄苷、菝葜皂苷元对照品(中国药品生物制品检定所，批号分别为:111730－200604 和 110744－200509);甲醇、氯仿、盐酸、氢氧化钠(AR，国药集团)

2 方法与结果

2.1 提取工艺条件及考察方案 玄参、知母所含有效成分为环烯醚帖苷和甾体皂苷，采用水为溶媒。在预试验的基础上，考察浸泡时间、加水倍数、煎煮时间三个因素对提取效果的影响，本文选用L9(34)正交表安排正交试验，以浸膏得率和哈巴俄苷、菝葜皂苷元的煎出率作为评价指标。

2.2 加减玉女煎吸水率实验 称取全方药材总重的1/3(30 g)各3份，常温下分别加10倍量水(25℃)浸泡，每30 min滤去表面水液后称重一次，称完后迅速再把药材放入原水液中浸泡，记录结果，直至吸水后的药材重量变化不明显为止。以时间为横坐标，药材湿重为纵坐标作图，结果见图1。实验结果显示，复方药材在浸泡120 min时，基本达到最大吸水量，吸水率约为100%(1倍)。

图1 复方药材重量变化与浸泡时间关系

2.3 最佳煎煮次数的考察及提取方案 分别称取全方总重的1/3(30 g)药材两份，各加10倍量水浸泡30 min后，煎煮1 h，滤过得一煎药液;药渣再加入10倍量水煎煮1 h，滤过得二煎药液;药渣再加入10倍量水煎煮1 h，滤过得三煎药液;三次煎煮药液分别浓缩，60℃减压真空干燥，称重。结果如下表1。

表1 两次投料煎煮分别所得干膏重量

从以上结果可以看出，三煎干膏提取率已经大大降低，从节约能源、降低成本等方面考虑，确定该复方的提取次数为两次。根据上述单因素考察结果，设计正交提取方案见表2～3。

表2 加减玉女煎正交表头设计L9(34)

2.4 样品提取 称取全方药材九份(每份90 g，成人一天入汤剂的量)，按正交表头设计进行试验，复方先用武火约30～40 min煮沸，后改用文火保持微沸，微沸维持时间按表2所示。两次煎液过滤合并，浓缩至适量，放冷转移到100 mL量瓶中定容。

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表3 加减玉女煎水提正交试验及结果

2.5 收膏率的测定 精密吸取各样品浓缩液5 mL，置干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，60℃减压真空干燥，置干燥器中冷却，迅速称重，计算干膏得率。

2.6 哈巴俄苷煎出率的测定［1］、［2］色谱条件:色谱柱:Kromasil C18色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流动相:乙腈－1%醋酸溶液线性梯度洗脱(20∶80→50∶50，20 min);流速:1 mL/min;检测波长:278 nm;柱温:25℃;在此色谱条件下理论塔板数按哈巴俄苷峰计算不低于5 000。

标准曲线的绘制:准确称取干燥至恒重的哈巴俄苷对照品2.04 mg，用适量30%甲醇溶解后，定容于10 mL量瓶中。精密吸取上述对照品溶液 0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.75 mL，分别置5 mL量瓶中，用30%甲醇稀释至刻度，摇匀。精密吸取上述对照品溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪，测定。以哈巴俄苷浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线并计算回归方程，回归方程为Y=47.711X+35.172，r=0.999 6，结果表明，哈巴俄苷在8.16～30.6 μg/mL呈良好的线性关系。

测定法:精密吸取各样品浓缩液5 mL，置干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，60℃减压真空干燥，放冷，干膏用30%甲醇适量溶解后，定容于50 mL量瓶中。摇匀，0.22 μm滤膜滤过，即得。各供试品溶液分别进样20 μL，依次测定峰面积，从标准曲线上读出各供试品溶液中哈巴俄苷浓度，计算哈巴俄苷煎出率。

2.7 菝葜皂苷元煎出率的测定［3，4］色谱条件:色谱柱:Kromasil C18色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流动相:甲醇－水(98:2);流速:1 mL/min;柱温:25℃;漂移管温度:62℃;气体流速:1.6 mL/min;不分流模式;在此色谱条件下理论塔板数按菝葜皂苷元峰计算不低于4 000。

标准曲线的绘制:准确称取干燥至恒重的菝葜皂苷元对照品7.58 mg，用适量甲醇溶解后，定容于25 mL量瓶中，摇匀。分别精密吸取上述对照品溶液各 1、2、4、6、8、9、10 μL，注入液相色谱仪，测定。以菝葜皂苷元进样量的对数值为横坐标，以峰面积的对数值为纵坐标，绘制标准曲线并计算回归方程，回归方程为Y=1.594 4X+3.555 8，r=0.999 94，结果表明，菝葜皂苷元在0.303 2～3.032 μg线性关系良好。

2.8 水提正交试验结果 各个因素水平对哈巴俄苷煎出率的影响并无显著性差异，但因素A和B对菝葜皂苷元的煎出率有显著作用。考虑到A2和A3相差不大、以及工厂常规操作的需要，浸泡时间确定为2 h;因素B应选B3即分别加12、10倍量水，鉴于C对各个指标并无明显影响作用，考虑到节约成本、减少浪费的需要，将提取时间定为1、1 h。由此确定最佳提取条件为:浸泡2 h，一煎加12倍量水、煎煮1 h，二煎加10倍量水，煎煮1 h，提取2次(见表4～6)。

表4 浸膏煎出率结果的方差分析

表5 哈巴俄苷煎出率结果的方差分析

表6 菝葜皂苷元煎出率结果的方差分析

2.9 验证试验 称取全方药材两份(每份90 g，成人一天入汤剂的量)，按照正交试验结果所确定的最佳提取工艺即浸泡2 h，一煎加12倍量水、二煎加10倍量水，煎煮提取两次，每次1 h，合并滤液，浓缩定容至100 mL量瓶中。取样，测定哈巴俄苷和菝葜皂苷元的煎出率，收膏率。结果见表7。

表7 验证试验结果

结果表明:用最佳工艺条件提取，干膏得率、哈巴俄苷和菝葜皂苷元的转移率均较稳定。

3 讨论

加减玉女煎主治温热病、高热烦渴，方中生石膏为君药、石膏性寒，主要为含水硫酸钙(CaSO4·2H2O)，此外还含有多种无机元素，如铜、铁、铝等［5］。有报道石膏的解热作用与硫酸钙无关，可能与所含的微量元素有关［6］。知母和玄参为臣药，已有文献报道，知母中菝葜皂苷元和玄参中哈巴俄苷对阴虚征候都具有一定的改善作用［7－9］，故选择这两个成分作为指标成分研究加减玉女煎的最佳提取工艺。

哈巴俄苷、知母皂苷均溶于水，因此可以利用水为溶媒将其提取出来，但两者化学结构又有所不同，前者属环烯醚萜苷，后者属甾体皂苷。环烯醚帖类成分的共性是不太稳定，随着加热时间的延长往往会受到破坏，对于此类成分的提取，要在保证达到最大提取率的情况下，尽量缩短提取时间。

皂苷类是知母中的主要有效成分，是衡量知母药材质量的最主要指标。知母皂苷类主要包括知母皂苷A类、B类、C类和D类等。这类成分在紫外无吸收，到目前为止，大多学者对于单味知母药材中皂苷类的HPLC含量测定研究较少，对于制剂中知母皂苷类的HPLC含量测定研究尚未见报道。菝葜皂苷元为脂溶性成分，它在知母中并不是主要的存在形式，而是知母药材经提取知母总皂苷，总皂苷水解后进一步纯化得到。知母所含甾体皂苷种类较多，水解后的皂苷元大多是菝葜皂苷元，因此它可以间接反映所含皂苷的总量，并且它具有一定的药理作用，结构清楚、性质稳定，所以2005版药典把它作为知母含量测定指标成分。但是，毕竟知母皂苷类的原本存在状态是以皂苷的形式，而不是皂苷元，在药材饮片煎煮或制成成药后起治疗作用的成分也是皂苷。又加之菝葜皂苷元样品处理过程繁琐、中间转移步骤多、易造成较大的误差，所以选择知母药材中含量较多的某一种皂苷成分进行定量研究和药材质量控制，应该更加合理，也值得进一步研究。

加减玉女煎除石膏外，其余四味都含有大量的糖和苷类。这两类成分具有良好的亲水性，容易被水提取出来。正交和验证试验都表明，水提加减玉女煎干膏的提取率基本都在40%左右，直接将其制成固体制剂尚有难度。因此，下一步的研究重点是在保证浸膏有效的前提下，选择合适的除杂工艺对浸膏进行精制。

［1］中国药典［S］.一部.2005:77.

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［5］宋友广，刘立干.清热中药话石膏［J］.时珍国医国药，1997，8(1):91.

［6］苏达世，万邦莉.石膏中无机元素的研究概况［J］.中国医院药学杂志，1989，9(4):166.

［7］中药知母有效组分－知母皂甙元“滋阴”作用的研究［J］.核技术，1991，5(14):262－265.

［8］丁元生，周月红，易宁育，等.知母皂甙元对甲高小鼠脑βAR的下调作用［J］.中药药理与临床，1990，6(2):15－16.

［9］谢丽华，刘洪宇，钱瑞琴，等.哈巴苷与哈巴俄苷对阴虚小鼠免疫功能及血浆环化核苷酸的影响［J］.北京大学学报(医学版)，2001，3(33):283－284.