复方桂术胶囊对小鼠Lewis肺癌的抑制及TNF-α和IFN-γ的影响

张树涌， 张 歌， 曹 勇， 张 娜， 宋 璟， 李可馨

(暨南大学医学院中医系，广东广州 510632)

复方桂术胶囊是由黄芪、肉桂、补骨脂、莪术、仙鹤草、半枝莲、瓜蒌皮组成的中药复方制剂，具有补肾益肺、化瘀解毒作用，临床观察表明，复方桂术胶囊方药对中晚期肺癌和肺癌化疗期及化疗后康复期，具有改善临床症状，减轻化疗毒副作用，提高生活质量，降低复发转移，延长肺癌患者生存期作用。复方桂术胶囊的前期研究表明其方药对多种肿瘤均具有抑制作用［1-2］，为了进一步证实其对肺癌的抑瘤作用，探讨复方桂术胶囊抗肿瘤作用机理，以小鼠Lewis肺癌为模型，研究复方桂术胶囊对荷瘤小鼠的抑瘤作用，并观察对其血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)的影响，从而为临床运用复方桂术胶囊治疗肺癌提供实验依据。

1 材料

1.1 药物 复方桂术胶囊:由暨南大学药学院中药制剂室提供，由黄芪、肉桂、补骨脂、莪术、仙鹤草、半枝莲、瓜蒌皮组成，每粒装 0.5 g，相当于生药 2 g，批号，091014。

1.2 动物 SPF级C57BL/6J小鼠:6～8周龄，体质量18～22 g，雌雄各半，中山大学实验动物中心提供，合格证号:SCXK(粤)2009-0011。

1.3 瘤株 小鼠Lewis肺癌:购于中国科学院上海细胞库。

1.4 试剂 TNF-α及IFN-γ ELISA试剂盒:购于武汉博士德生物公司。

1.5 主要仪器 超净工作台:苏州安泰空气技术有限公司;倒置显微镜:日本Nikon;酶标仪:奥地利TZCAN公司。

2 方法

2.1 肺癌动物模型 在无菌条件下，取传代10 d的Lewis肺癌瘤源小鼠，脱颈椎处死，无菌操作从腋部皮下剥取肿瘤组织，研磨后按1∶3比例加生理盐水稀释成瘤细胞悬液，并调整细胞浓度为1×107/mL，取C57BL/6J小鼠，每鼠0.2 mL右前肢腋部皮下注射。

2.2 动物分组及给药 动物造模24 h后，称质量随机分为模型对照组，正常动物组，中药高剂量组，中药中剂量组和中药低剂量组。每组10只，雌雄各半。分组后，模型对照组及正常动物组，灌胃等容积蒸馏水。复方桂术胶囊用蒸馏水稀释，高剂量组按20 g/kg(为临床成人日用量的10倍)灌胃给药，中剂量组按10 g/kg(为临床成人日用量的5倍)灌胃给药，低剂量组按5 g/kg(为临床成人日用量的2.5倍)灌胃给药，每日1次，连续10 d。

2.3 肺癌抑制率的测定 第11天称体质量并处死动物，解剖瘤体称质量。按下式计算肿瘤抑制率:肿瘤抑制率=(对照组平均瘤质量－给药组平均瘤质量)/对照组平均瘤质量×100%。

2.4 血清TNF-α和IFN-γ质量测定 第11天动物称质量后，无菌条件下摘眼球取血，静置4 h，离心分离血清，置－20℃冰箱备用。根据试剂盒操作说明，采用ELISA双抗体夹心法，用全自动酶标仪检测。

血清TNF-α检测操作:① 分别将标本及不同浓度标准品加入96 孔板中(100 μL/孔)，37 ℃ 孵育 90 min，洗板;②加入生物素抗体工作液(100 μL/孔)，37℃孵育60 min，洗板;③ 加入酶结合物工作液(100 μL/孔)，避光孵育30 min，洗板;④ 加入显色底物100 μL/孔，37℃避光孵育10～15 min;⑤ 加入终止液100 μL/孔，混匀后即刻测量 OD450值。每个标准品和标本的OD值减去零孔的OD值，手工绘制标准曲线，以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查其浓度。

血清IFN-γ检测操作:① 按标准品稀释方法加好标准品(100 μL/孔)，在每个样品孔中加入50 μL试剂稀释液和50 μL样本;② 在样本和标准孔中加入50 μL生物素化抗体工作液，室温(20～25℃)孵育120 min，洗板;③ 加入酶结合物工作液(100 μL/孔)，室温(20 ～25 ℃)孵育 60 min，洗板;④ 加入显色底物100 μL/孔，室温(20～25℃)，避光孵育10 min;⑤ 加入终止液100 μL/孔，混匀后即刻测量OD450值。标准曲线绘制及同血清TNF-α。

2.5 观察抑瘤作用 第11天处死动物后解剖瘤体称质量，按下列公式计算瘤质量抑制率:肿瘤抑制率(%)=荷瘤模型空白对照组平均瘤质量－给药组平均瘤质量)/荷瘤模型空白对照组平均瘤质量×100%。

3 结果

3.1 复方桂术胶囊对小鼠Lewis肺癌的抑制作用 结果见表1。

表1 复方桂术胶囊对小鼠Lewis肺癌的抑制作用

从表1可以看出，对小鼠Lewis肺癌，复方桂术胶囊高、中剂量组均有显著的抑瘤作用(P＜0.05)，而低剂量组抑瘤作用则不显著(P＞0.05)。

3.2 复方桂术胶囊对小鼠Lewis肺癌血清TNF-α的影响结果见表2。

表2 复方桂术胶囊对小鼠Lewis肺癌血清TNF-α的影响

从表2可以看出，对Lewis肺癌小鼠血清TNF-α量，与正常动物组相比，模型组显著降低(P﹤0.001)，中药高剂量组显著升高(P﹤0.05)，而中药中剂量组与中药低剂量组仍未升高至正常水平，二者有显著性差异(P﹤0.05)，尤以中药低剂量组最为显著(P﹤0.001)。与模型对照组比较，中药高、中剂量组小鼠血清TNF-α水平均显著升高，尤以中药高中剂量组最为显著(P﹤0.001)，中药低剂量组虽有所升高，但不明显(P＞0.05)。

3.3 复方桂术胶囊对小鼠Lewis肺癌血清INF-γ的影响结果见表3。

表3 复方桂术胶囊对小鼠Lewis肺癌血清INF-γ的影响

从表3可以看出，对Lewis肺癌小鼠血清INF-γ量，与正常动物组相比，模型组显著降低(P＜0.001)，中药高中低剂量组均显著降低，尤以中药中剂量组与中药低剂量组降低最为显著(P＜0.001)。与模型对照组比较，中药高剂量组小鼠血清INF-γ水平显著升高(P＜0.001)，而中药中剂量和低剂量组升高不显著(P＞0.05)。

4 讨论

在肿瘤发生、发展过程中，细胞因子TNF-α与IFN-γ发挥着不可忽视的作用。目前，TNF-α、IFN-γ可作为肿瘤治疗反应、治疗机制和治疗效果判断的生物学指标［3］。

本实验结果显示复方桂术胶囊能促进TNF-α的产生，而且随着中药剂量的增大，血清中TNF-α水平显著提高。TNF-α在肿瘤机体免疫功能中是非常重要的细胞因子，近年来被用于肿瘤细胞的凋亡及联合化疗药物治疗，被认为是与肿瘤恶化有关的细胞因子，与肿瘤恶病质有关，同时又是一种免疫调节因子，具有调节机体免疫功能作用［4-5］。TNF-α具有直接杀伤肿瘤细胞的作用，体现在某些磷脂酶、蛋白酶和核酸酶等，这些酶都是杀伤肿瘤细胞不可缺少的水解酶。而且，它还可以通过间接作用杀伤肿瘤细胞，例如阻断肿瘤细胞血液供应，增加肿瘤血管内皮细胞的凝血活性，使血管内皮细胞受损，以及抑制血管内皮细胞迁移等［6］。本实验结果还显示，复方桂术胶囊高中低剂量组均能能促进IFN-γ的产生，但以中药高剂量组最为显著。IFN-γ与肿瘤发生、发展及转移密切相关，有抗肿瘤细胞增殖作用，还有免疫调节作用，可介导T细胞对巨噬细胞的激活，并能直接增强巨噬细胞的杀伤能力;可诱导某些肿瘤细胞表达 MHC-Ⅱ和MHC-Ⅰ类抗原，促进静止的CD4+T细胞变化为Th1细胞，并抑制Th2细胞的增殖，促进CD8+CTL的成熟，增强CD8+CTL和NK细胞的杀伤活性［7-8］。通过抑制肿瘤细胞的增生，改变肿瘤细胞表面的性能及诱发新的抗原而被免疫监视细胞识别并加以排斥，实现抗肿瘤效应和增强机体抗肿瘤能力。另外，IFN-γ还可通过血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)基因转录发挥其抑制肿瘤血管生长的作用［9］。并且本实验研究结果还显示，复方桂术胶囊对小鼠肺癌具有显著的抑制作用，表明复方桂术胶囊对动物肺癌的抑制与增强荷瘤小鼠细胞因子TNF-α、IFN-γ的免疫作用密切相关。

综上所述，复方桂术胶囊不但能显著抑制小鼠肺癌，而且能影响荷瘤小鼠外周血清TNF-α及IFN-γ细胞因子水平，从结果可以看出:随着其剂量的增加，可使血清中TNF–α的水平明显提高，而其还能显著提高血清中IFN-γ的水平。这为临床使用复方桂术胶囊抗癌机理从细胞因子水平上提供了一定的实验依据。复方桂术胶囊的抑瘤作用，是否是其复方中的某些成分对肿瘤细胞具有直接的细胞毒作用，或是通过对细胞信号转导通路发挥作用，具体的作用环节和作用机制有待进一步研究。

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