红花注射液热转化的HPLC/UV/MS特征图研究

任爱农， 姚苗苗， 王大为

(1.江苏省中医药研究院，江苏 南京 210028;2.江苏大学药学院，江苏 镇江 212013)

红花注射液是以菊科植物红花Carthamus tinctoriusL.为原料制成的注射液，具有活血化瘀功能，临床用于治疗闭塞性脑血管疾病，冠心病，脉管炎。主要含有红花中水溶性较强的黄色素类成分。近代研究表明红花的黄色素类成分为活血化瘀的主要成分，可抑制血小板激活因子诱发的血小板聚集与释放，为一血小板激活因子受体拮抗剂［1-4］，但是它的热不稳定性也屡见报道［5-9］。我们曾采用HPLC方法对原药材进行了检测［10］，还采用了指纹图谱检测方法对红花氯化钠大输液制备过程中的热稳定性进行了跟踪考察［11］;本实验又应用 HPLC/UV/MS联用技术对红花注射液中热转化产物进行研究，将HPLC对复杂样品的高分离能力与MS的高选择性、高灵敏度以及能够提供分子质量与结构信息的优点结合起来，对红花黄色素的热不稳定性进行深层次的分析。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters-2695型HPLC色谱仪(四元泵、在线脱气及自动进样系统、2996型二极管阵列检测器);Micromass公司Quattro micro质谱仪，串联四极杆质谱检测器，ESI接口，Masslynx 4.0数据处理系统;Milli-Q纯水器(美国)。除乙腈为色谱纯外，其余试剂均为分析纯。

1.2 试剂与样品 乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，超纯水;红花购于四川简阳，由南京中医药大学刘训红教授进行品种和质量鉴定;红花注射液(雅安三九药业有限公司，规格:20 mL，批号:070407;亚宝药业集团股份有限公司，规格:20 mL，批号:070110-1);羟基红花黄色素A(批号111637-200502)购于中国药品生物制品检定所。

2 方法与结果

2.1 样品的制备 取红花注射液直接作为供试品(1);再取红花药材粉末(过3号筛)约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入双蒸水100 mL，称定质量，超声处理(功率300 W，频率50 kHz)40 min，放冷，再称定质量，用双蒸水补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液10 mL作为供试品溶液(2);再取续滤液50 mL置100 mL圆底烧瓶中100℃加热回流2 h，作为供试品溶液(3)。取对照品羟基红花黄色素A(safflomin A)用双蒸水制成质量浓度为0.075 1 mg/mL对照品溶液。

2.2 色谱/质谱条件及分析方法 色谱柱Alltima C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相 乙腈(A)－0.2%乙酸(B)，梯度洗脱(0 ～30 min，10%A;30 ～50 min，15%A;50 ～ 55 min，25%A;55 ～ 60 min，10%A);体积流量 0.7 mL/min，检测波长 403 nm，310 nm;柱温30℃。柱后分流0.4 mL/min进质谱仪，同时记录总离子流(TIC)色谱图。检测方式ESI(+/－);扫描范围100～1 000;干燥气体积流量;10 L/min;雾化室压40 psi;毛细管电压4 000 V;传输电压70 eV。进样量20 μL。

2.3 HPLC/UV/MS色谱图的建立

2.3.1 色谱分离 实验过程中尝试用水-甲醇、水-乙腈体系的分离，发现乙腈的洗脱能力较强，分离较好;在水相中加入乙酸使流动相体系呈弱酸性，能有效改善峰形和分离度，所以确立了2.2项下色谱条件对供试品和对照品进行分离;并且通过DAD检测器在200～600 nm范围内全波长扫描。供试品(1):当波长在403 nm时，10 min左右处呈现羟基红花黄色素A色谱峰、21 min左右处又呈现出一个峰;波长在310 nm时33 min处又见一个明显色谱峰。供试品(2):当波长在403 nm时10 min左右处呈现羟基红花黄色素A色谱峰、21 min左右和42 min左右处又各出现一个明显的吸收峰，310 nm波长时无明显色谱峰，供试品(3)当波长在403 nm时羟基红花黄色素A和21 min左右的峰仍然存在，42 min左右时的色谱峰消失，310 nm波长时33 min左右处新产生了一个明显的吸收峰，所以，确立403 nm、310 nm为色谱图的检测波长。红花注射液和红花水提取液受热前后的HPLC/UV的色谱图见图1。

2.3.2 质谱检测 为全面检测红花注射液及红花水溶液受热成分变化情况，分别以正、负离子模式检测。红花注射液是以红花为原料制成的注射液，其主要有效成分为查尔酮类物质。该类成分除21 min左右的峰仅适合在负离子模式下检测，其余各峰在正、负离子检测模式下均可检测，但是在负离子检测模式时效果更好。红花注射液及红花水溶液受热前后的HPLC/MS TIC图，见图2。

图2是在2.2质谱条件下进样分析得到的负离子扫描图，结合正离子扫描结果，各分子离子的信息见表1。

表1 图2中推导的4个可能化合物Tab.1 The four possible compounds derived in Fig.2

2.4 质谱解析结果 由表1可见1号峰与羟基红花黄色素A对照品比较可确定为羟基红花黄色素A;2号峰可能是羟基红花黄色素A的同分异构体;3号峰初步推测为查尔酮类物质;4号峰初步推测为橙酮类物质。

3 讨论

图1 红花注射液和红花水提取液受热前后的HPLC/UV色谱图Fig.1 HPLC/UV characteristic peaks of Honghua Injection and Carthami Flos extract water before and after being heated

图2 红花注射液和红花水提取液受热前后的HPLC/MS总离子流图［ESI(－)］Fig.2 HPLC/MS total ion chromatograms［ESI(－)］of Honghua Injection and Carthami Flos extract water before and after being heated

3.1 由红花注射液、红花水提液受热前后色谱图可见10 min左右的羟基红花黄色素A峰及22 min左右的峰对热较稳定，在红花药材及红花注射液中均出现;33 min左右时出现的峰为红花水提取液受热转化的产物，红花药材中没有，在红花注射液中含有，说明该种成分是在红花注射液制备过程中受热转化所致;42 min左右时的峰对热不稳定，红花药材中有，红花注射液中没有，说明该物质在红花注射液制备过程中受热被破坏了。

3.2 红花注射液所含成分复杂，并且由于红花黄色素受热不稳定的特点，增加了其特殊性。33 min左右时的峰是热转化产物，未见该物质有关报道，本文首次报道了该物质的热转化，但是，仅展示了该物质的分子量和紫外光谱特征，更深层次的结构特征和药理活性有待于进一步研究。

3.3 42 min左右时出现的峰是原红花药材中固有的，量较高，可能具有类似红花样的作用，有文献报道为红花黄色素A(Safflower yellow A)，相对分子质量是594［12-13］，这可能是质谱设置参数时分子质量范围窄滤除了分子质量大的物质而引起的。我们的研究结果分子质量是1 043，对此物质未见红花成分研究中有关报道，可能是该物质对热不稳定性失去了它的研究价值，这提示我们可通过分子修饰增加结构的稳定性。

［1］贾菲菲，柴秋彦，贾 俊，等.红花黄色素B抗凝作用研究［J］.实验中医药学，2009，10(3):13-15.

［2］臧宝霞，金 鸣，李金荣.羟基红花黄色素A抗凝作用的研究［J］.中草药，2007，38(5):741-743.

［3］臧宝霞，金 鸣.羟基红花黄色素A对血小板活化因子的拮抗作用［J］.药学学报，2002，37(9):696-699.

［4］金 鸣，吴 伟.红花总黄色素体外抑制血小板激活因子受体结合作用的研究［J］.中国药学杂志，2001，36(3):167-169.

［5］罗 晶，黄宇玫，曾文雪.红花中羟基红花黄色素A的提取工艺及其热稳定性研究［J］.江西中医学院学报，2009，21(5):39-41.

［6］李 红，黄罗生，平其能，等.红花黄色素的稳定性考察［J］.海峡药学，2009，21(1):12-14.

［7］马晓宇.干红花中红花黄色素的稳定性研究［J］.内蒙古石油化工，2007，(11):22-24.

［8］张 莉.天然红花黄色素的提取及稳定性研究［J］.食品研究与开发，2003，24(4):46.

［9］吴冬青，林 敏，王学文，等.红花黄色素稳定性研究［J］.河西学院学报，2003，19(5):32-36.

［10］姚苗苗，任爱农，董仲才.RP-HPLC法同时测定红花中羟基红花黄色素A与红花黄色素A的含量［J］.药物分析杂志，2010，30(2):263-265.

［11］任爱农，高 燃，朱玲英，等.HPLC指纹图谱对红花大输液制备过程中的热稳定性的考察［J］.中成药，2009，31(2):165-168.

［12］王慧琴，谢明勇，傅博强.红花中红花黄色素含量的反相高效液相色谱测定［J］.分析科学学报，2005，21(4):408-410.

［13］Takahashi Y，Miyasaka N，Tasaka S，et al.Constitution of two coloring matters in the flower petals ofCarthamus tinctoriusL.［J］.Tetrahedron Letts，1982，23:5163-5166.