逍遥散高效液相色谱指纹图谱的研究

李会娟， 张 宁*， 李秋红， 王业秋， 王发善， 陈巧云

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150040;2.多多药业有限公司，黑龙江佳木斯 154007)

逍遥散源于《太平惠民和剂局方》，具有疏肝解郁、调和气血的功效，是治疗肝郁脾虚的常用方剂［1］。逍遥散在临床上广泛应用于妇科、肝胆病、胃肠病、神经官能症、心脑血管病及糖尿病、肿瘤等躯体疾病继发的抑郁状态［2-3］。吴丽丽等［4］、张崇燕等［5］采用自主活动、小鼠悬尾实验和强迫游泳等方法均证明逍遥散有明显的抗抑郁作用，丁国安等［6］临床观察逍遥散加味联合米氮平治疗产后抑郁症，效果良好，不良反应少。

逍遥散由八味药组方，其成分复杂，目前主要采用HPLC测定芍药苷、阿魏酸、甘草甜素等少数成分的方法［7］，对逍遥散及其成方制剂进行质量评价，这不能全面反映其内在质量，需要一种全面、简单易行的方法来评价逍遥散的质量。指纹图谱能较全面地反映出组方中的成分［8］，因此本实验应用HPLC对逍遥散进行指纹图谱的研究，建立逍遥散指纹图谱的共有模式，以实现多成分评价逍遥散及其成方制剂的质量的方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1200 series液相(G1322A Degasser，G1311A Quat Pump，G1329A ALS，G1316A TCC，G1315D DAD);Venusil XBP C18(天津博纳艾杰尔科技有限公司)色谱柱;BT224S万分之一电子天平(赛多利斯);KQ5200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004 A);中草药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.2 药材与试剂 乙腈(色谱纯;Burdick＆Jackson.);娃哈哈纯净水;甲醇、磷酸为分析纯。逍遥散遵照《太平惠民和剂局方》并结合临床用量，确定组方:柴胡 30 g、白芍 30 g、当归 30 g、白术 30 g、茯苓30 g、甘草 15 g、薄荷10 g、炮姜 10 g，自制而成。以上药材均购自北京同仁堂制药集团哈尔滨药店，经黑龙江中医药大学佳木斯学院陈孝忠副教授鉴定。

2 方法与结果

2.1 逍遥散 取10批逍遥散组方药材，粉碎，过2号筛，按组方比例混合。

2.2 供试品溶液的制备

2.2.1 准确称取逍遥散 1.85 g，加甲醇 20 mL，超声提取两次(30 min，15 min)，合并滤液，蒸干，用甲醇定容为10 mL，溶液过0.45 μm微孔滤膜，作为供试品溶液。

2.2.2 以逍遥散1.85 g计，按组方比例称取逍遥散各单味药，提取方法同上。

2.3 色谱条件的确立

2.3.1 检测波长的确定 190 nm～400 nm全波长扫描，经比较后发现280 nm处基线平稳，出峰多，故确定检测波长为280 nm。

2.3.2 流动相的选择 本实验比较了甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液4种流动相洗脱系统，结果乙腈-0.2%磷酸水溶液梯度洗脱时峰的分离度和峰形都比较好，所以选择乙腈-0.2%磷酸水溶液作为流动相。梯度见表1。

表1 流动相梯度Tab.1 The gradient of mobile phase

2.3.3 色谱柱的考察 实验过程中考察了依利特ODS-2C18、依利特 ODS-C18、Thermo ODS-2C18、Venusil XBP C18色谱柱，比较后发现，Venusil XBP C18色谱柱出峰多，分离度好，故选择Venusil XBP C18色谱柱进行逍遥散的成分研究。

2.3.4 色谱条件的确立 根据上述结果，最终确立的色谱条件为:色谱柱Venusil XBP C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);柱温 35 ℃;体积流量 1.0 mL/min;检测波长280 nm;流动相乙腈-0.2%磷酸水溶液，梯度见表1。在上述色谱条件下，取供试品溶液进样10 μL进行HPLC测定，结果见图1。

图1 逍遥散的指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprint of Xiaoyao Powder

2.4 共有峰的确定 按照2.1项制备逍遥散样品10批，用2.3.4项下色谱条件测定了10批逍遥散的指纹图谱，采用国家药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(版本2004 A)，确定22个共有峰(见图2，表2)，其相对保留时间的RSD均小于1%。

2.5 参照峰的选择 保留时间为40.6 min的色谱峰，峰面积较大，出峰时间适中且稳定，经标准品对照认定为甘草苷的吸收峰(见图3)，因此选择甘草苷作为参照物。

2.6 方法学考察

图2 10批逍遥散的HPLC指纹图谱Fig.2 HPLC fingerprints of 10 batches of Xiaoyao Powder

图3 甘草苷标准品与逍遥散样品对照色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of liquiritin and Xiaoyao Powder sample

表2 10批样品出峰数目及共有峰所占比例Tab.2 The peak number of 10 batches of Xiaoyao Powder and the proportion of common peaks

2.6.1 精密度实验 取同一供试液相同条件连续进样5次，记录指纹图谱。结果表明，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于1%，符合指纹图谱要求，表明仪器精密度良好。

2.6.2 重复性实验 按2.1项制备5份供试品溶液，分别进样10 μL，记录指纹图谱。结果表明，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%，符合指纹图谱要求，重复性良好。

2.6.3 稳定性实验 取同一供试液分别在0、4、8、16、24 h进样，记录指纹图谱。结果表明，各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%，说明供试样品在室温下24 h内稳定性良好。

2.7 相似度计算 采用国家药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(版本2004 A)，对10批逍遥散的指纹图谱进行分析，以色谱峰的平均值建立对照指纹图谱，利用相关系数法计算指纹图谱的相似度，均不小于0.99，结果见表3。

表3 逍遥散10批相似度计算结果(S:共有模式)Tab.3 Similarity caculations of 10 batches of Xiaoyao Powder(S:the common pattern of Xiaoyao Powder)

2.8 共有峰归属认定 利用平均值生成逍遥散的共有模式(见图4)。以逍遥散比例按2.2项下制备逍遥散各单味药及其阴性对照组方的样品，用2.2.4项下色谱条件进样生成指纹图谱，以保留时间和光谱确认各共有峰的来源(见图4)。来源于白芍的是:2、3、5、6、12 号峰，来源于当归的是:1、2、4、5、6、8、9、11、14、20、22 号峰，来源于甘草的是 6、7、10、16、18号峰，来源于薄荷的是 13、15、17 号峰，来源于炮姜的是19、22号峰，其中2、5号峰是白芍和当归共有成分，6号峰是白芍、当归和甘草共有成分，22号峰为当归和炮姜的共有成分。21号峰在单味药中未找出其来源，可能是在样品制备过程中药物相互作用产生的新成分。在逍遥散的八味药中柴胡、茯苓、白术没有色谱峰显示在共有模式中。

图4 逍遥散与单味药对照色谱图和各共有峰紫外光谱图(x轴:nm，y轴:mAU)Fig.4 HPLC chromatogram of Xiaoyao Powder and single Chinese medicine and UV spectrum of common peaks

3 讨论

3.1 本实验建立了逍遥散的HPLC指纹图谱，采用国家药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(版本2004 A)，生成了逍遥散指纹图谱的共有模式，确定了22个共有峰，计算了10批逍遥散的指纹图谱的相似度，均在0.99以上，且各色谱峰相对保留时间稳定，这说明本试验方法所建立的指纹图谱具有较好的稳定性和可控性，可以从整体定性评价逍遥散的质量优劣。同时，本实验明确了22个共有峰的生药归属，为逍遥散的定量指标的选择和确定提供了参考。

3.2 中药复方是中医药应用于临床的经验总结，传统研究的水平限制了中药复方的发展。中药复方药效物质基础不清楚，药效不明确阻碍了中药复方走向世界。逍遥散是临床常用的经典方剂，但其药效物质基础不明确。杨玉兴等［9］对肝郁脾虚患者口服加味逍遥散后阿魏酸的药动学进行研究，但单成分不能完全阐述逍遥散的药效作用机制。指纹图谱技术是量化表达和解析中药药效物质基础整体特征的重要手段［10］，本实验指纹图谱技术所建立的逍遥散体外全成分分析方法，为逍遥散体内成分研究、药效物质基础的确定以及配伍规律的解析等奠定了扎实的基础。

［1］李 冀.方剂学［M］.北京:中国中医药出版社，2006:91-92.

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［3］修 春，宓穗卿，王宁生.逍遥散的药理研究进展［J］.中国药房，2007，18(9):702-703.

［4］吴丽丽，徐志伟，严 灿，等.逍遥散和丹栀逍遥散抗抑郁作用的实验研究［J］.中医研究，2003，16(3):14-15.

［5］张崇燕，唐永鑫，曾 南，等.逍遥散及其组方对行为绝望抑郁模型小鼠的影响［J］.成都中医药大学学报，2009，32(2):51-53.

［6］丁国安，余国汉，梁绍材，等.逍遥散加味联合米氮平治疗产后抑郁症的临床效果［J］.广东医学，2010，31(16):2163-2165.

［7］邱美贤.逍遥散复方配伍颗粒质量标准规范化研究［D］.广州:广州中医药大学，2006.

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