参参康心胶囊对小鼠缺血心肌线粒体超微结构及Na+、Mg2+、Ca2+含量的影响

刘喜平， 李沛清， 刘 勍， 吴红彦

(1.甘肃中医学院，甘肃 兰州 730000;2.天水师范学院，甘肃天水 741000)

新药参参康心胶囊源于名老中医验方，由水蛭等三味药物组成，经现代制药工艺加工而成，临床应用多年，对冠心病、心肌梗死等心肌损伤性疾病有显著疗效，以往研究表明该制剂可减轻阿霉素(ADR)心肌毒性［1］及垂体后叶素(Pit)所致心肌损伤，其作用机理与抗氧化，清除氧自由基、调节ATP酶活性有关［2］，本文进一步探讨了参参康心胶囊对小鼠缺血心肌超微结构及心肌线粒体Na+、Mg2+、Ca2+含量的影响，以期为临床应用提供科学依据。

1 材料

1.1 实验动物 昆明种普通级健康小鼠，♀♂各半，体重(30.0±2.0)g，由兰州大学医学实验中心提供。动物合格证号:医动字第 14－005。

1.2 实验药物 参参康心胶囊:处方由水蛭等三味药物按一定的比例组成。由兰州中药现代化工程技术中心及甘肃中医学院科研实验中心监制，规格为每粒0.5 g(每粒相当于生药1 g)，实验时用生理盐水溶解为120 mg生药/mL。地奥心血康胶囊:成都地奥制药集团有限公司，批号:0503079代号022，国药准字:Z10910051。

1.3 试剂及仪器 匀浆介质，参考文献法［2］配制备用。52羟葵酸(美国sigma公司)。电子天平(Sartorius BL150，北京赛多利斯仪器系统有限公司);离心机(D－37520，德国);数显恒温水浴锅(HH－4，郑州杜甫仪器厂);紫外分光光度计(UV－9100，北京瑞利分析仪器公司);透射电镜:规格型号:JEM－1230，日本产。CCD相机:美国GATAN公司产。

2 方法

2.1 动物分组及给药 将小鼠随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组(地奥心血康组)、心肌缺血模型+参参康心胶囊(小剂量组、中剂量组、大剂量组)，每组10只。参参康心胶囊剂量按50 kg成人常规剂量折算后作为中剂量组(3 g生药/kg体重)，高剂量组为中剂量组放大一倍(6 g生药/kg体重)，小剂量组为中剂量组缩小一倍(1.5 g生药/kg体重)。各剂量组每天灌胃2次，空白对照组及模型组每日给予相同体积的生理盐水，连续5 d，阳性对照组按0.076 g/kg，1 mL/次灌胃。模型组及各用药组小鼠在第5天灌胃30 min后腹腔注射Pit(剂量30 u/kg体重)［3］，空白对照组第5天腹腔注射等体积生理盐水。

2.2 线粒体的分离 颈椎脱臼处死，取出心脏称重，用冰冷的生理盐水制成匀浆，4℃ 2 000 r/min离心10 min，取上清液，将此上清液再4℃ 10 000 r/min离心15 min，沉淀为线粒体，沉淀用20倍的冰冷匀浆介质制备成混悬液［4］。

2.3 心肌线粒体超微结构的观察 动物分组、复制模型方法同上，注射Pit15 min后，参考文献方法［5］，将手术摘取的心脏剪去心房部，在冰的磷酸缓冲液中洗去血液，切成小块(1 mm3)，分别置于3%戊二醛中固定。按电镜常规制作方法将切成小块的心肌组织在1/15 mol的磷酸缓冲液中漂洗3次，每次10 min;漂洗后用1%锇酸固定1 h 20 min;再次用1/15 mol的磷酸缓冲液漂洗3次，每次10 min;逐级用50%、70%、80%、90%、100%的乙醇脱水各 10 min;后用100%丙酮脱水10 min;以1∶1的比例用包埋剂EPON包埋浸透2 h;在35℃、45℃、60℃条件下各聚合24 h;用超薄切片机切片，厚度为60～80 nm;用饱和醋酸钠及枸橼酸铅双染色(双染法)透射电镜观察与摄片。

2.4 线粒体的形态计量分析 参考文献方法［6］，每只小鼠观察2个铜网，每个铜网照2张底片，放大倍数均为20 000倍。各组电镜底片应用HPIAS－1000图文分析系统进行形态计量分析，计算线粒体的体密度(即线粒体体积与胞质体积的比值)、比表面(线粒体外膜面积与线粒体体积之比)、面数密度(参照系截面单位内的颗粒数目)。

2.5 心肌线粒体Na+、Mg2+、Ca2+含量的测定 取少量线粒体沉淀用硝酸消化后，用原子吸收分光光度仪测定其钠、钙、镁含量。其吸收量与含量成正比，与标准系列比较进行定量。

2.6 统计学处理 采用SPSS13.0软件统计，用t检验。计量资料以均数±标准差(±s)表示。

3 结果

3.1 各组小鼠心肌细胞线粒体超微结构的改变 结果见图1。经透射电镜观察，空白对照组心肌结构正常，粗细肌丝排列整齐有序，清晰完整，肌节整齐，线粒体大小形态正常，内部嵴排列有序，结构清晰完整可见;模型组肌丝排列疏松，肌节不清晰，不完整，有明显的肌丝融合，形成多处肌融灶线粒体不完整，有多处肿胀破裂，线粒体嵴模糊，断裂融合，形成空泡;阳性对照组显示肌节整齐，肌丝无疏松现象，线粒体致密呈凝聚状，线粒体嵴结构不清晰，排列致密;小剂量组肌丝轻度疏松，但肌节基本整齐，线粒体较完整，线粒体嵴排列结构尚清晰完整;中剂量组和大剂量组均显现肌节整齐，肌丝排列有序，肌膜平整，其中，中剂量组线粒体大小形态较正常，无肿大表现，嵴结构基本清晰完整;大剂量组线粒体大小形态正常，线粒体嵴排列基本有序，结构清晰。

图1 小鼠心肌细胞线粒体超微结构的改变

3.2 各组小鼠心肌细胞线粒体的形态计量分析 结果见表1。模型组体密度明显增大，面数密度、比表面均减小，差异有统计学意义(P＜0.05);与模型组比较，各用药组体密度均减少，面数密度、比表面均增大，参参康心胶囊大剂量组作用明显，差异有统计学意义(P＜0.05)，而参参康心胶囊小、中剂量组与阳性组相比差异无统计学意义。

表1 各组小鼠心肌细胞线粒体的形态计量分析结果(± s，n=40)

表1 各组小鼠心肌细胞线粒体的形态计量分析结果(± s，n=40)

注:与空白组比较，*P＜0.05;与模型组比较，△P＜0.01。

组别 体密度/% 面数密度/μm－2 比表面/μm －1空白组32.79±5.54 0.871±0.150 32.75±7.23模型组 48.65±8.64* 0.791±0.119 25.57±7.30*小剂量组 37.82±5.83 0.741±0.098* 28.12±4.15*中剂量组 35.84±7.31* 0.776±0.112* 27.84±4.41*△大剂量组 34.28±6.53*△ 0.837±0.121* 32.55±6.65△阳性组 36.74±6.31* 0.790±0.123* 28.90±4.35*△

3.3 各组小鼠心肌细胞线粒体Na+、Mg2+、Ca2+含量 结果见表2。模型组的线粒体Na+与Ca2+浓度高于空白组，Mg2+浓度低于空白组，差异有统计学意义(P＜0.01)。参参康心胶囊各组及阳性对照组Na+与Ca2+浓度均低于模型组，有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);Mg2+浓度则高于空白组，差异有统计学意义(P＜0.01)，参参康心胶囊大剂量与中、小剂量间有剂量－效应关系(P＜0.05);参参康心胶囊中、小剂量间差异无统计学意义。

表2 各组小鼠心肌细胞线粒体Na+、Mg2+、Ca2+含量(± s，n=10)

表2 各组小鼠心肌细胞线粒体Na+、Mg2+、Ca2+含量(± s，n=10)

注:与模型组比较，*P＜0.05，△P＜0.01;与空白组比较，▲P＜0.01。

组别 Na+/(μg/mg) Mg2+/(μg/mg) Ca2+/(μg/mg)空白组15.48±4.25 14.38±3.35 2.01±0.56模型组 24.57±5.86▲ 8.85±2.68▲ 2.86±0.27▲小剂量组 24.35±4.18 9.43±2.64* 2.34±0.48*中剂量组 23.49±5.25* 10.21±2.98* 2.31±0.54*大剂量组 21.25±3.83△ 13.23±3.97△ 2.17±0.51△阳性组 23.26±5.36* 10.59±4.21△ 2.67±0.42*

4 讨论

心肌缺血属中医“胸痹”、“心痛”范畴。中医认为该病以本虚标实为其病理特征。本虚责之于气、血、阴、阳不足，以心气不足最为突出，标实主要涉及气滞、血瘀、痰饮、寒凝、火热等病理产物或因素，以心络瘀阻为主。故气虚血瘀是心肌缺血性疾病的主要发病机制，故以益气养心，活血通络为防治心肌缺血性疾病的基本治法。参参康心胶囊组方严谨，药少力专，功能益气养心，活血通络，使气旺促血行，祛瘀而不伤正。垂体后叶素收缩冠状动脉，导致心肌供血不足，收缩全身小血管，导致心脏负荷加重，常用于诱导心气虚证动物模型［7］，本研究选用该模型作为心肌缺血动物模型。

线粒体是维持机体细胞氧化及能量产生的重要功能单位，是一种膜性细胞器，其重要的生物学功能是氧化代谢和钙代谢。线粒体对缺血、缺氧十分敏感，是清除氧自由基酶系统活力最重要的部位和决定细胞由可逆到不可逆改变的关键细胞器［8］。本实验观察到参参康心胶囊干预后心肌线粒体肌节整齐，肌丝排列有序，肌膜平整线粒体大小形态较正常，无肿大表现，嵴结构清晰完整。从形态学方面证实了参参康心胶囊保护缺血心肌细胞线粒体的结构与功能。

心肌缺血时发生细胞内外Ca2+分布的失衡，细胞内钙超载是心肌缺血损伤的特征之一。线粒体对钙离子的摄取主要是通过线粒体内膜两侧的电位差和钙离子浓度差的驱动下完成，属耗能过程，对维持胞质钙浓度的稳定有重要的意义。在缺血缺氧线粒体内膜一方面要摄取胞质超载的钙离子，一方面要利用膜两侧的电位差合成ATP。在心肌缺血和缺氧的情况下，由于Na+K+－ATP酶被抑制，细胞内Na+也发生积聚，继而发生Ca2+超载。本研究显示:心肌缺血时，线粒体中钠、钙、镁的含量出现不同程度的改变。Mg2+含量的减少，Na+、Ca2+含量增多，从而加重了能量代谢障碍。这与我们以往研究参参康心胶囊显著提高Na+K+－ATP酶活性完全一致［2］。

线粒体的体密度为参考系统中线粒体所占的百分数，线粒体的面数密度是指单位参考系统中线粒体的数目，比表面是反映结构与功能关系最重要的形态参数。在相同表面积情况下，体积越大，比表面越小，反之体积越小，比表面越大，在相同体积情况下，球的比表面最小。本实验发现，在心肌缺血后，心肌线粒体等超微结构严重受损，其体密度明显增大，而面数密度、比表面显著减少，表明线粒体高度水肿，数量减少，线粒体膜及基本结构发生病变。从形态计量学测量结果来看，模型组体密度最大，面数密度、比表面最小，提示此组线粒体水肿最严重，超微结构的破坏也以模型组最重，与线粒体变化一致，而各用药组较模型组体密度减少，面数密度、比表面增大，心肌损伤程度也较轻，参参康心胶囊各组可减轻缺血造成的心肌线粒体水肿，阻止缺血心肌膜损伤，维持膜结构的完整性，从而保护心肌超微结构，尤以参参康心胶囊大剂量组作用明显。

［1］吴红彦，张建刚，刘永琦，等.参参康心胶囊抗阿霉素心肌毒性的实验研究［J］.中国实验方剂学杂志，2003，9(3):18－19.

［2］李沛清，王 燕，刘喜平，等.参参康心胶囊对缺血小鼠心肌线粒体损伤的保护作用［J］.中医药学报，2007，35(1):19－21.

［3］赵明奇，刘 艳，赵丹洋，等.通心络改善缺血心肌供血的NO机制研究［J］. 中国实验方剂学杂志，2003，9(6):43－45.

［4］斯佩克特.细胞实验指南［M］.北京:科学出版社，2001:20.

［5］吴建新，王一心，钮荣祥，等.心脉龙对大鼠异丙肾上腺素性缺血心肌的保护作用［J］.中国病理生理杂志，2002，18(1):97－98.

［6］李艳茹，彭 力，马海英，等.非酶糖基化致衰老小鼠心肌超微结构和线粒体形态计量改变的研究［J］.电子显微学报，2002，21(5):529－530.

［7］李绍芝，朱文锋，黄献平，等.心气虚证动物模型的研制［J］.中国中医基础医学杂志，2000，6(7):466－471.

［8］雷 厉.大鼠缺血心肌线粒体损伤及其意义［J］.江西医学院学报，1998，36(1):9－12.