野菊花水煎剂中7种药效组分的含量测定

吴明侠， 王晶娟， 张贵君*

(1.河南中医学院，河南 郑州 450008;2.北京中医药大学，北京 100102)

野菊花Chrysanthemi Indici Flos是常用中药，功效清热解毒。实验研究发现，其清热解毒的药效组分主要是黄酮和有机酸类化合物。目前，野菊花中成分的研究多是对总黄酮及黄酮类成分的含量测定［1-7］，而有机酸类成分则只是测定其中绿原酸的含量［8-11］，且多采用有机溶剂进行提取，但传统中药临床多是以水煎液用药，故水提液中所含成分才是其临床有效成分。

本试验选择不同产地的野菊花为研究载体，探讨其水提液中黄酮类及有机酸类药效组分同时测定的方法，旨在为中药药效组分分析方法的建立提供科学数据，为野菊花质量标准的建立提供方法和思路。

1 仪器与试药

Agilent 1100高效液相色谱仪;Sartorius BP211D型电子天平;T-250B超声波清洗机(天鹏电子新技术有限公司);FD-1型冷冻干燥机(北京博医康技术公司)。

绿原酸对照品(批号:11075-200413)、咖啡酸对照品(批号:111885-200602)、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷对照品(批号:111720-200604)、蒙花苷对照品(批号:111528-200605)、木犀草素对照品(批号:11075-200512)，均购自中国药品生物制品检定所。3，5-二咖啡酰奎尼酸购自成都曼思特生物科技有限公司，秋英苷为本实验室自制，用质谱确认并经液相归一化法标定，含量为98.2%。

乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯，水为屈臣氏纯净水。

野菊花:菊科植物野菊Chrysanthemum indicumL.的干燥头状花序，由北京中医药大学张贵君教授鉴定。

2 方法与结果

2.1 液相色谱条件 Diamonsil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相:A 相为0.5%磷酸水溶液，B相为乙腈，进行梯度洗脱，在0～10 min，B相从10%线性改变至20%，10～30 min，B相从20%线性改变至30%;30～40 min，B相从30%线性改变至40%;流速:1.0 mL/min;检测波长:326 nm;柱温:35℃。对照组分及供试品色谱图见图1。

图1 野菊花HPLC色谱图A.对照组分 B.野菊花样品1.绿原酸 2.咖啡酸 3.木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷 4.3，5-二咖啡酰奎尼酸 5.秋英苷 6.蒙花苷 7.木犀草素Fig.1 HPLC chromotograms of Chrysanthemi Indici FlosA.Standard active components B.Chrysanthemi Indici Flos1.chlorogenic acid 2.caffeic acid 3.3，5-O-dicaffeoylquinic acid 4.luteolin-7-O-glucoside 5.apigenin-7-O-β-D-glucoside 6.buddleoside 7.luteolin

2.2 野菊花水煎剂的制备 取不同产地野菊花样品20 g，精密称定，加25倍量水浸泡10 min，煎煮2次，每次20 min，滤过，滤渣用水洗涤2次，合并水提液，浓缩至适量，置冻干机中制成冻干粉，收集冻干粉，精密称定重量，计算提取率，备用。

2.3 对照组分溶液的制备 分别精密称取7种药效组分对照品适量，加甲醇溶解，配制成绿原酸、咖啡酸、3，5-二咖啡酰奎尼酸、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、秋英苷、蒙花苷、木犀草素浓度分别为0.122 4、0.027 2、0.295 2、0.056 4、0.043、0.262、0.022 mg/mL的混合对照组分溶液。

2.4 供试品溶液的制备 取不同产地野菊花冻干粉约0.5 g，精密称定，置10 mL量瓶中，加水溶解，并稀释至刻度，用0.45 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

2.5 线性关系的考察 精密吸取对照组分溶液1、5、10、15、20 μL，按上述色谱条件测定峰面积;以峰面积积分值为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程分别为:

绿原酸Y=3 424.68X－11.20，r=0.999 84;咖啡酸Y=2 507.11X+12.79，r=0.999 88;3，5-二咖啡酰奎尼酸Y=1 482.81X－8.65，r=0.999 91;木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷Y=3 032.28X+0.29，r=0.999 90;秋英苷Y=1 405.55X－9.09，r=0.999 72;蒙花苷Y=1 946.93X+54.14，r=0.999 91;木犀草素Y=2 393.07X－0.24，r=0.999 81。

结果表明，绿原酸在0.122 4～2.448 μg之间，咖啡酸在0.027 2 ～0.544 μg 之间，3，5-二咖啡酰奎尼酸在0.295 2 ～5.904 μg之间，木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷在0.056 4～1.128 μg之间，秋英苷在0.043～0.86 μg之间，蒙花苷在0.262 ～5.24 μg 之间，木犀草素在0.022～0.44 μg之间呈现良好的线性。

2.6 重复性试验 精密称取同一产地野菊花冻干粉5份，按2.4项下方法制备供试品，按2.1项下色谱条件测定含量(相当于原药材中，n=5)，绿原酸的含量为0.222 6%，RSD为1.55%;咖啡酸的含量为0.031 5%，RSD为1.84%;3，5-二咖啡酰奎尼酸的含量为0.220 1%，RSD为1.75%;木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷的含量为 0.069 0%，RSD 为1.84%;秋英苷的含量为0.064 7%，RSD为1.63%;蒙花苷的含量为0.516 9%，RSD为1.36%;木犀草素的含量为0.014 2%，RSD为1.95%。

2.7 精密度试验 精密吸取混合对照组分溶液10 μL，重复进样5次，测定峰面积，绿原酸、咖啡酸、3，5-二咖啡酰奎尼酸、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、秋英苷、蒙花苷及木犀草素的RSD分别为0.88%、0.94%、0.81% 、0.74% 、0.62% 、0.99% 和 1.23% 。

2.8 稳定性试验 精密吸取供试品溶液5 μL，分别于配制后0、3、6、9、12 h测定各色谱峰峰面积。绿原酸、咖啡酸、3，5-二咖啡酰奎尼酸、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、秋英苷、蒙花苷及木犀草素的RSD分别为1.67%、1.40%、1.16%、1.78%、1.89%、1.65%和1.53%。结果表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.9 回收率试验 取已测定含量的安徽金寨野菊花药材5份，每份0.8 g，精密称定，分别精密加入对照组分适量，加25 mL水煎煮2次，每次20 min，滤过，滤渣洗涤2次，合并滤液，浓缩至10 mL，经0.45 μm微孔滤膜滤过，按2.1项下色谱条件进行测定，计算各自的量。绿原酸、咖啡酸、3，5-二咖啡酰奎尼酸、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、秋英苷、蒙花苷及木犀草素的平均回收率分别为98.07%、98.73%、98.12%、98.59%、98.24%、98.75% 和 98.31%，RSD分别为 1.96%、0.73%、1.01%、1.14%、1.10%、1.02%和1.00%。

2.10 样品的含量测定 分别精密称定不同产地野菊花冻干粉，按2.4项下方法制备供试品，按2.1项下色谱条件进行测定，进样量为5 μL，计算含量。结果见表1、表2。

表1 不同产地野菊花含量测定(n=5)Tab.1 The contents of Chrysanthemi Indici Flos from various habitats(n=5)

表2 不同产地野菊花含量测定(n=5)Tab.2 The contents of Chrysanthemi Indici Flos from various habitats(n=5)

3 讨论

3.1 采用HPLC法测定了野菊花水煎剂中黄酮类及有机酸类成分的含量。流动相曾对甲醇-磷酸水及乙腈-磷酸水系统进行了考察，最终采用乙腈-0.5%磷酸水系统进行梯度洗脱，能同时测定其中绿原酸、咖啡酸、3，5-二咖啡酰奎尼酸、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、秋英苷、蒙花苷、木犀草素7种成分的含量，并进行了方法学考察，结果表明该方法简便快速，精密度和重现性良好，回收率合格，可作为野菊花的质量控制方法。

3.2 含量测定结果表明，不同产地野菊花水煎剂中

各成分含量差异较大。目前野菊花常用炮制工艺是先将其炒制后再晒干，而梅山、青山、古碑3个产地的野菊花是采集后直接晒干，未经过炒制过程，其中3，5-二咖啡酰奎尼酸、蒙花苷含量明显较其他产地高。而其他产地野菊花中，3种有机酸类成分含量趋势基本一致。一种成分含量高，其它两种成分也相对含量较高。

3.3 2005年版中国药典中野菊花项下是以蒙花苷作为其质量控制指标［12］，但目前市售野菊花多是炒制后晒干制成，其中蒙花苷含量要低于直接晒干的炮制品，因此单以蒙花苷的含量高低评价野菊花的质量优劣是否可行，野菊花中的药效组分究竟是哪些成分，还需进一步探讨。

［1］林春蕊.野菊花总黄酮的含量测定［J］.广西植物，2002，22(5):467.

［2］陈 蕾，朱霁虹.HPLC法测定野菊花中蒙花苷的含量［J］.中国药事，2005，19(2):97.

［3］钱频非，葛 滨，王殿广.高效液相色谱法测定野菊花中木犀草素的含量［J］.中国药房，2005，16(22):1741.

［4］谭晓杰，贾 英，李 清，等.RP-HPLC法同时测定野菊花中木犀草素-7-O-葡萄糖苷和蒙花苷［J］.中草药，2006，37(8):1261.

［5］张珊珊，彭艳梅，吴 艳.HPLC法测定夏桑菊颗粒中蒙花苷含量研究［J］.中医药导报，2007，13(4):79.

［6］宋宏刚，裴彩云，赵韶华，等.不同产地野菊花药材中蒙花苷及总黄酮含量测定［J］.中成药，2008，30(4):556.

［7］王伯涛，柯天英，王 锋，等.不同产地野菊花质量分析比较［J］.江苏中医药，2008，40(11):95.

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［9］袁学勤，迟静波，胥 云.HPLC测定野菊花中绿原酸的含量［J］.中成药，2005，27(4):493.

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［11］陈怀冰.HPLC法测定感冒灵颗粒中绿原酸的含量［J］.海峡药学，2009，21(1):53.

［12］中国药典［S］.一部.2005:219.