夜交藤改善睡眠活性成分研究

汲广全， 杨 娟， 杨小生

(贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州贵阳 550002)

随着社会的发展、现代生活节奏的加快以及生活方式的改变，各种睡眠障碍性疾病日益成为一个突出的问题，失眠则被列为最常见的几种睡眠疾病之首［1］。对于失眠症的治疗，与西药相比，中药以其药源广泛、副作用和依赖性小等优势日益受到人们关注［2］。

夜交藤为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorumThunb.的藤茎或带叶藤茎，又名首乌藤［3］。夜交藤作为一种常用中药，性平无毒、味甘微苦，具有养心安神，祛风通络之功效［4］。目前对夜交藤改善睡眠的报道［5－7］，主要是对其水煎剂及不同种类化学成分总提物的改善睡眠活性进行研究，而夜交藤中改善睡眠的活性成分还不明确，本实验对夜交藤改善睡眠活性部位的化学成分进行了分离纯化，并发现了其具有较好改善睡眠效果的活性成分。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

夜交藤(Caulis polygoni multiflori)采自贵州省施秉县何首乌种植示范基地，为何首乌Polygonum multiflorumThunb的藤茎;♂性昆明小鼠，18～22 g，由贵阳医学院实验动物中心提供［生产许可证号:SCXK(黔)2002－0001］。D101型大孔树脂(沧州宝恩化工有限公司);戊巴比妥钠(国药集团化学试剂有限公司，批号:WS20060401);枣仁安神制剂(贵州同济堂制药公司，批号:20090702);褪黑素胶囊(惠普生，南宁富莱欣生物科技发展有限公司，批号:HP00045)。

1.2 方法

1.2.1 样品的制备 称取夜交藤干燥药材1 kg，粉碎，用75%乙醇回流提取3次，每次2 h，提取液减压浓缩至无醇味，得到夜交藤醇提物。夜交藤醇提物加适量水混悬，用石油醚进行萃取，得到石油醚萃取部分和水部分。

对石油醚萃取后的水层部分湿法上大孔树脂柱，用乙醇梯度洗脱，分别得到大孔树脂蒸馏水洗脱部分，30%，60%和90%乙醇洗脱部分。

1.2.2 实验分组 将70只小鼠随机分为7组，每组10只，分别为石油醚萃取组、蒸馏水洗脱组、30%乙醇洗脱组、60%乙醇洗脱组、90%乙醇洗脱组、空白对照组和枣仁安神制剂阳性对照组。

1.2.3 供试品的配制

(1)石油醚浸膏灌胃液的制备:称取该浸膏溶于由花生油、吐温和水(1:1:8)配制的溶液中;

(2)空白对照:为生理盐水;

(3)阳性对照:为市售药用枣仁安神制剂，水溶液配制;

(4)蒸馏水洗脱部分灌胃液:用蒸馏水配制;

(5)30%，60%和90%部分灌胃液:1%羧甲基纤维素钠配制。

1.2.4 改善睡眠试验［8－9］对戊巴比妥钠阈下催眠剂量的影响:小鼠连续灌胃3 d，于末次灌胃30 min后，各组小鼠腹腔注射25 mg/kg戊巴比妥钠阈下催眠剂量，观察在30 min内翻正反应消失的小鼠只数(翻正反射消失1 min以上者)。

延长戊巴比妥钠睡眠时间试验:小鼠连续灌胃3 d，于末次灌胃30 min后，各组小鼠腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥钠阈上催眠剂量，观察记录腹腔注射后小鼠翻正反应消失(翻正反射消失1 min为指标)到恢复的时间，即睡眠持续时间。

2 结果与分析

2.1 夜交藤改善睡眠活性部位的确定

从表1可以看出，在戊巴比妥钠阈下催眠剂量实验中，30%乙醇洗脱组和60%乙醇洗脱组小鼠入睡只数分别为5只和4只，与空白组比较有显著差异，而与酸枣仁阳性对照组比较无统计学意义;在戊巴比妥钠阈上催眠剂量实验中，30%和60%乙醇洗脱组与空白对照组相比差异极显著(P＜0.01)，与酸枣仁阳性对照组相比，差异不显著，说明这两部分具有较好的改善小鼠睡眠活性。

表1 夜交藤各组分对小鼠睡眠的影响(n=10，±s)

表1 夜交藤各组分对小鼠睡眠的影响(n=10，±s)

注:与空白组相比，*P＜0.05，**P＜0.01;与阳性对照组相比，△P＜0.05，△△P ＜0.01。

组别 给药剂量/(g/kg)小鼠入睡只数小鼠睡眠时间/min可延长睡眠时间/%空白组 0 0△ 41.9±5.3△△ －48.5石油醚萃取组 6.1(生药) 0△ 45.0±5.6△△ 7.2蒸馏水洗脱组 6.1(生药) 0△ 40.8±4.3△△ －30%乙醇洗脱组 6.1(生药) 5* 60.9±8.4** 47.7 60%乙醇洗脱组 6.1(生药) 4* 64.5±8.1** 53.9 90%乙醇洗脱组 6.1(生药) 1△ 43.9±6.5△△ 4.7枣仁安神制剂组 0.168(制剂) 5* 62.2±7.9**

2.2 夜交藤活性部位化学成分的分离纯化

2.2.1 提取与分离 另取夜交藤干燥药材20 kg，按照1.2.1项所述方法得到大孔树脂60%乙醇洗脱部分(231g)。将该洗脱部分进行硅胶柱层析，氯仿－甲醇梯度洗脱，得到Fr 1～Fr 4四个部分。其中Fr 1和Fr 2部分分别经硅胶柱层析，石油醚－丙酮(10∶1)洗脱后，用Sephadex LH－20凝胶柱纯化得化合物1和化合物2;Fr 3部分经反复硅胶柱层析，氯仿－甲醇(20∶1)洗脱得到化合物3和化合物4。

2.2.2 结构鉴定 化合物1:黄色晶体，EI－MSm/z(%):284［M］+(100);1HNMR(400 MHz，CDCl3)δ:7.61(1H，s，5－H)，7.35(1H，s，4－H)，7.08(1H，s，7－H)，6.69(1H，s，2－H)，3.94(3H，s，Ar－OCH3)，2.45(3H，s，Ar－CH3)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:190.8(C－9)，182.0(C－10)，166.4(C－3)，165.1(C－1)，162.1(C－8)，148.4(C－6)，135.2(C－5a)，133.2(C－4a)，124.5(C－7)，121.2(C－5)，113.7(C－1a)，110.0(C－8a)，108.2(C－4)，106.6(C－2)，56.0(Ar－OCH3)，22.0(Ar－CH3)。以上数据与文献［10］相符，化合物鉴定为大黄素甲醚。

化合物 2:橙黄色针晶，EI－MSm/z(%):270［M］+(100);和大黄素对照品对照，TLC的Rf值和显色一致，确定为大黄素。

化合物 3:黄色针晶，EI－MSm/z(%):284 ［M－glu］+(100);1H－NMR(400 MHz，DMSO－d6)δ:13.03(1H，s，1－OH)，7.46(1H，s，5－H)，7.33(1H，d，J=2.4 Hz，4－H)，7.16(1H，s，2－H)，7.16(1H，s，7－H)，5.15(1H，d，J=7.2 Hz，糖上端基H，β构型)，4.70(1H，t，J=6.0 Hz，糖上 C6－OH)，3.16～3.75(6H，m，糖上的6个 H)，3.95(3H，s，6－OCH3)，2.40(3H，s，3－CH3);13C－NMR(100 MHz，DMSO－d6)δ:186.5(C－9)，181.9(C－10)，164.7(C－6)，161.7(C－8)，160.7(C－1)，147.2(C－3)，136.4(C－5a)，132.1(C－4a)，124.3(C－2)，119.4(C－4)，114.5(C－1a)，114.4(C－8a)，107.3(C－7)，106.5(C－5)，100.6(glu－C－1)，77.5(glu－C－5)，76.6(glu－C－3)，73.3(glu－C－2)，69.8(glu－C－4)，60.8(glu－C－6)，56.1(6－OCH3)，21.5(3－CH3)。与文献［11］对照确定为大黄素甲醚－8－O－β－D－葡萄糖苷。

化合物 4:黄色针晶，EI－MSm/z(%):270 ［M－glu］+(100);1H－NMR(400 MHz，DMSO－d6)δ:13.08(1H，s，1－OH)，7.41(1H，s，5－H)，7.26(1H，d，J=2.4 Hz，4－H)，7.11(1H，s，2－H)，6.99(1H，d，J=2.4 Hz，7－H)，5.04(1H，d，J=7.6 Hz，糖上端基H，β构型)，4.64(1H，t，J=6.0 Hz，糖上 C6－OH)，3.32～3.73(6H，m，糖上的6 个 H)，2.37(3H，s，3－CH3);13C－NMR(100 MHz，DMSO－d6)δ:186.4(C－9)，182.1(C－10)，164.2(C－6)，161.7(C－8)，161.1(C－1)，146.9(C－3)，136.5(C－5a)，132.0(C－4a)，124.2(C－2)，119.3(C－4)，114.4(C－1a)，113.3(C－8a)108.4(C－7)，108.4(C－5)，100.8(glu－C－1)，77.3(glu－C－5)，76.4(glu－C－3)，73.3(glu－C－2)，69.4(glu－C－4)，60.6(glu－C－6)，21.4(3－CH3)。与文献［11］对照确定为大黄素－8－O－β－D－葡萄糖苷。

2.3 改善睡眠活性成分的确定

由于化合物1和化合物3在药材中的含量较低，分离得到的量不足以进行整体动物试验，所以只对化合物2(大黄素)和化合物4(大黄素－8－O－β－D－葡萄糖苷)进行了改善睡眠试验。将50只小鼠随机分为5组，分别为大黄素组、大黄素糖苷组、空白组、枣仁安神制剂和褪黑素阳性对照组，改善睡眠试验同1.2.4项。从表2可以看出:大黄素糖苷组在戊巴比妥钠阈下催眠剂量实验中小鼠入睡只数与枣仁安神制剂组和褪黑素组相接近，而与空白组相差较大;在戊巴比妥钠阈上催眠剂量实验中，大黄素糖苷组小鼠睡眠时间与空白组差异极显著(P＜0.01)，而与两个阳性对照组差异不显著，说明大黄素－8－O－β－D－葡萄糖苷具有较好的改善小鼠睡眠活性。

表2 夜交藤活性部位化学成分对小鼠睡眠的影响(n=10，±s)

表2 夜交藤活性部位化学成分对小鼠睡眠的影响(n=10，±s)

注:与空白组相比，*P＜0.05，**P＜0.01;与阳性对照组相比，△P＜0.05，△△P ＜0.01。

组别 给药剂量/(mg/kg)小鼠入睡只数小鼠睡眠时间/min可延长睡眠时间/%空白组 0 1△ 36.9±7.4△△ －大黄素组 45 1△ 41.6±12.0△△ 12.7大黄素糖苷组 45 5* 59.0±15.3** 59.9枣仁安神制剂组 168 6* 54.3±9.7** 47.2褪黑素 84 7* 61.1±18.9**65.6

3 讨论

夜交藤中主要含有蒽醌类成分、二苯乙烯苷类成分，含量较高的代表性化合物分别为大黄素、2，3，5，4′－四羟基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷［4］。关于蒽醌类成分改善睡眠功能的报道，有学者提到大黄能延长巴比妥类药物助睡眠时间，大黄素42 mg/kg可延长睡眠时间18.7%，芦荟大黄素40 mg/kg可延长睡眠时间64.3%，大黄酸作用最强，47 mg/kg可延长睡眠时间 87.8%［12］。本研究发现大黄素－8－O－β－D－葡萄糖苷也有改善睡眠的作用，而大黄素改善睡眠的作用与空白组比较差异不显著。至于大黄素苷比大黄素苷元改善睡眠效果好的原因有待进一步研究。此外，从夜交藤各分段提取物改善睡眠实验结果可以看出，除了大孔树脂60%乙醇洗脱部分具有较好的改善睡眠活性外，大孔树脂30%乙醇洗脱部分也同样具有较好的改善睡眠活性。但是由于该洗脱部位化学成分极性较大，给分离纯化工作带来极大困难，因此要全面系统的了解夜交藤中改善睡眠的活性成分有待于进一步的研究。

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