Lewisy抗原及α1，2-岩藻糖转移酶基因在卵巢癌细胞系中的表达

梁秀云，林蓓，刘娟娟，高利利，王燕燕，刘大我，严丽梅，张淑兰

（中国医科大学附属盛京医院妇产科，沈阳 110004）

卵巢癌发病率居女性生殖系统恶性肿瘤的第三位，近年有上升趋势。由于卵巢肿瘤发病和进展隐匿，确诊时70%已属晚期，晚期卵巢癌5年生存率仅约30%［1］。卵巢癌浸润、转移、耐药是造成卵巢癌治疗困难的主要原因。岩藻糖基可参与构成某些重要黏附分子的糖链结构，在肿瘤的增殖、黏附及转移机制上起重要作用［2~4］。Lewisy抗原是含有双岩藻糖的寡糖，一些肿瘤标志物的分子结构中如卵巢癌相关标志物CA125和MUC-1也含有Lewis y结构，说明Lewisy抗原与上皮性卵巢癌有关［5］。我们的前期工作中利用基因转染技术建立了α1，2-岩藻糖转移酶（α1，2-fucosyltransferases，α1，2-FT） 基因及Lewis y抗原高表达的卵巢癌细胞RMG-I-H，转染后细胞的恶性生物学行为明显增强［6］。由于Lewisy抗原位于细胞表面，在生物检测和生物治疗方面有着广阔的应用远景。

本研究通过检测α1，2-FT基因FUT1转染前后的人卵巢癌细胞系RMG-I和RMG-I-H、人卵巢癌高转移细胞系HO8910PM及亲本细胞系HO8910、人卵巢癌耐药细胞系COC1/DDP及亲本细胞系COC1中Lewis y抗原及FUT1基因的表达，进一步证明Lewis y抗原与肿瘤的耐药和转移关系，为我们进一步研究Lewis y抗原对卵巢癌细胞增殖的影响及作用机制，为研究卵巢癌的发生发展机制奠定基础，为卵巢癌的早期诊断及靶器官治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系：人卵巢癌细胞系RMG-I细胞来自人卵巢透明细胞癌组织，由日本近畿大学岩森正男教授惠赠；RMG-I-H 细胞为 α1，2-FT（FUT1）及 Lewis y抗原稳定高表达卵巢癌细胞系，在我们前期研究中已建立［8］；人卵巢癌细胞株HO8910PM、HO8910、COC1/DDP和COC1购于中国科学院上海细胞生物研究所。

1.1.2 主要材料与仪器：DMEM培养基、1640培养基、胎牛血清（美国GIBCO公司产品）；鼠抗人Lewis y单克隆抗体（英国Abcam公司）；TRITC标记的兔抗小鼠IgG抗体（DAKO公司产品）；SP试剂盒（福州迈新公司）；RT-PCR试剂盒（大连宝生物工程公司）；Trizol试剂，PrimeScriptTMRTreagent kit、SYBR誖Premix Ex TaqTM购于大连TaKaRa生物工程公司；引物序列由上海Invitrogen公司合成；其余化学药品均为国产分析纯；台式低温超速离心机3-16K（美国Sigma-Aldrich公司）；电泳仪（美国Bio-Rad公司）；电泳槽（美国Bio-Rad公司）；自动凝胶成像分析仪GDS8000（美国 UVP 公司）；PCR 扩增仪（480，2400，9600型）（美国PerkinElmer公司）；紫外分光光度仪（UV300，PYE-WNICAM/SPECTRONIC）（上海生物仪器厂）；倒置显微镜及照相系统IX70（日本OLYMPUS公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：RMG-I和RMG-I-H细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养液中于37℃、5%CO2的培养箱中饱和湿度培养；HO8910PM和HO8910人卵巢癌细胞株接种于含10%小牛血清的RpMI1640培养液中，37℃，5%CO2培养箱中培养；COC1（悬浮生长）培养于37℃，5%CO2，含10%胎牛血清的1640培养液中。COC1/DDP（悬浮生长）顺铂耐药细胞株，应用药物连续作用并逐步提高药量的递增压力选择法，在同样的条件下使其能在0.5 pg/mL顺铂的1640培养液中稳定生长。

1.2.2 细胞总RNA提取：取以上6种细胞（各约1×107个细胞）加1 mLTRIZOL试剂，室温放置5~10 min以裂解细胞，收集裂解液于Eppendorf管，一步法提取细胞总RNA。紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度。按照大连TaKaRa生物工程公司RNA逆转录试剂盒说明书合成cDNA。经紫外分光光度计测量cDNA浓度和纯度。证明合成的cDNA适用于下一步的实时PCR分析。

1.2.3 Quantitative RT-PCR检测：利用Quantitative RT-PCR测定以上6种细胞中FUT1基因及内源对照3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因表达水平。FUT1 PCR引物序列为 F：5′AGGTCATCCCTGAGCTGAAACGG 3′；R：5′CGCCTGCTTCACCACCTTCTTG3′。GAPDH引物序列为 F：5′GGACTTCGAGCAAGAGATGG3′；R：5′ACATCTGCTGGAAGGTGGAC3′。实时荧光定量PCR反应体系包括：SYBR誖Premix Ex TaqTM（2×）5 μl，PCR Forward Primer（5 μmol/L）0.5 μL，PCR Reverse Primer（5μmol/L）0.5μL，cDNA 1μL，dH2O 3 μL。反应条件为：95 °C 变性 20 s，60°C 退火 60 s，共45个循环。应用Light Cycler PCR检测系统（Roche Diagnostics，Mannheim，德国）进行 Real-time PCR 扩增并检测各范本的Ct值。扩增完毕后，进行溶解曲线分析。目的基因表达倍数的改变利用2－ΔΔCT法进行计算。2－ΔΔCT结果＞1.4 或者＜0.6 被认为是有意义。

1.2.4 RT-PCR检测：各取4μg总RNA逆转录合成cDNA，反应条件为50℃30 min，95℃5 min，5℃5 min。取逆转录产物2.5μL行PCR扩增，反应体系为：10×缓冲液2.5μL，2.5 mmol/L脱氧核苷三磷酸2 μL，5 U/μL 的 Taq聚合酶 0.2μL，上下游引物各 0.5 μL，cDNA 2.5μL，H2O 16.8μL，总体积 25μL；反应条件为：94℃，5 min后，94℃，40 s；退火温度，62℃，1 min；72℃，1 min，最后为 72℃，7 min，35循环。PCR产物在3.5%琼脂糖凝胶中进行电泳后，经电泳凝胶成像分析仪ALPHA IMAGER 5500拍照并分析处理。β-actin 引物序列为 F：5′GGACTT-CGAGCAAGAGATGG3′；R：5′ACATCTGCTGGAAGGTGGAC3′扩增片断长度，404 bp。

1.2.5 免疫细胞化学检测：取RMG-I-H和RMG-I、HO8910PM和HO8910细胞爬片，4%多聚甲醛固定。免疫细胞化学染色方法按SP试剂盒说明书进行。Lewis y单抗 AH6，1∶100稀释；IgM 二抗，1∶100稀释。以细胞质、细胞膜有棕黄色颗粒着色为阳性。实验重复3次。图像分析软件Meta Morph分析结果。

将悬浮细胞COC1/DDP和COC1分别放入离心管中，1 000 r/min离心5 min，用PBS洗2次，用少量的PBS把细胞涂于预先用多聚赖氨酸处理好的载玻片上，玻片待干燥时用4%多聚甲醛固定。其余步骤同上。

1.2.6 免疫细胞荧光检测：细胞爬片和涂片同免疫细胞化学。4%多聚甲醛固定20 min，用PBS洗2次，每次3 min，5%BSA封闭30 min，加入一抗（抗Lewisy 1∶100）。4℃过夜。二抗TRITC标记的兔抗小鼠IgG单抗，1∶50稀释，避光37℃1 h，暗室内40倍镜下拍照。

1.3 统计学处理

应用SPSS17.0统计分析软件，检测数据以x±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3对细胞系中Lewisy抗原的表达

SP染色结果表明，Lewis y分布于细胞膜和细胞质，Lewis y在 RMG-I、HO8910、COC1 细胞中染色阳性颗粒呈淡黄色，分布弥散，累积光密度分别为（32.18±0.64），（14.96±0.61）和（19.26±0.83）（图 1），在 RMG-I-H、HO8910PM和COC1/DDP细胞中，染色阳性颗粒呈棕黄色或棕褐色，分布广泛，其累积光密度分别为（53.90±4.33），（37.31±0.19）和（28.52±1.45）。均比相应的RMG-I、HO8910、COC1细胞明显增强（P均<0.05）。在相同的瀑布强度下免疫细胞荧光检测结果显示RMG-I-H、HO8910PM和COC1/DDP细胞中荧光强度明显强于RMG-I、HO8910、COC1细胞（图2）。

图 1 RMG-I和 RMG-I-H、HO98910和 HO8910PM、COC1和COC1-DDP细胞系中Lewis y的表达×400Fig.1 Lewis y expression in RMG-Iand RMG-I-H，HO98910 and HO8910PM，COC1 and COC1-DDP celllines×400

图 2 RMG-I和RMG-I-H、HO98910和HO8910PM、COC1和COC1-DDP细胞系中Lewis y的表达×400Fig.2 Immunofluorescence microscopy of Lewis y carbohydrate determinants from RMG-I-H and RMG-I，HO98910 and HO8910PM，COC1 and COC1-DDP ovarian carcinoma cells×400

2.2 3对细胞系中FUT1基因的表达

Real-time PCR检测结果证明，RMG-I-H细胞中FUT1的mRNA相对表达量较RMG-I细胞升高了3.07倍（P<0.05），HO8910PM细胞中的相对表达量较HO8910细胞升高了2.13倍（P<0.05），COC1/DDP细胞中相对表达量比COC1细胞升高了2.42倍（P<0.05）（表1）。RT-PCR检测结果显示RMG-I-H、HO8910PM和 COC1/DDP细胞中 FUT1基因的相对表达明显强于RMG-I、HO8910、COC1细胞中FUT1基因的表达（图3）。

表1 实时定量PCR测定6种细胞中FUT1基因的表达水平Tab.1 Real-time PCR determine the gene expression of FUT1 in these six cells

图 3 RMG-I和 RMG-I-H、HO8910和 HO8910PM、COC1和COC1/DDP中FUT1 mRNA的相对表达Fig.3 The mRNA expression of FUT1 in RMG-I and RMG-I-H，HO8910 and HO8910PM，COC1 and COC1/DDP cell lines

3 讨论

近年来，越来越多的研究表明糖复合物上的糖链结构参与调节细胞功能，如信号转导、分子黏附等，与细胞生长、凋亡、运动、分化等重要生命过程密切相关［8~10］。细胞癌变后细胞膜上的糖复合物、特别是糖链部分发生结构和量的变化。卵巢癌主要表现为Ⅱ型糖链的改变，如Lewisy抗原。研究表明75%的上皮性卵巢癌出现Lewis y不同程度的过量表达，且增高的患者预后不良［11，12］。

Lewis y抗原是某些糖蛋白和糖脂的末端寡糖，为双岩藻糖寡糖，其化学结构为［Fuc1→2Gal1→4（Fuc 1→3）GlcNAc］，即糖链非还原末端的二糖-半乳糖-N-乙酰氨基葡萄糖（Gal-N-GlcNAc），在其外侧的半乳糖上连接有α1→2岩藻糖（Fuc）及α1→3岩藻糖（Fuc）而形成。研究证实，α1，2-FucT 中FUT1是Lewisy寡糖的特异性合成酶 FUT1［14］。

前期我们利用基因转染技术将FUT1导入人卵巢癌细胞系RMG-I，首次建立了α1，2-FT基因及lewisy稳定高表达的卵巢癌细胞模型RMG-I-H。并且证明在卵巢癌细胞RMG-I-H中，α1，2-FT基因及Lewisy抗原使其增殖、侵袭等恶性细胞生物学能力增加的同时，对卵巢癌化疗中的常用药物卡铂、5-氟尿嘧啶及紫杉醇的耐药性也提高［2，4，6］。基因转染后细胞系RMG-I-H与RMG-I相比，RMG-I-H中的多药耐药相关蛋白1、多药耐药相关蛋白2、蛋白激酶C-α及拓扑异构酶Ⅰ的基因表达均明显上调，在RMG-I-H及其裸鼠移植瘤中P-gp在基因和蛋白水平表达都明显增高［14］。Lewis y抗体能明显抑制体内外细胞的生物学特性的改变［15］。Chhieng等［16］用免疫组化法分别检测了在原发性卵巢癌及转移灶组的Lewisy表达，发现Lewisy抗原的表达在原发灶和转移灶无明显差异。这些结果证实，Lewisy抗原在卵巢癌的恶性生物学行为中扮演重要角色，与卵巢癌细胞耐药和转移能力有关。本实验结果表明，在RMG-I-H中，Lewisy抗原和FUT1基因高表达使其在增殖和耐药及侵袭能力上都比RMG-I增强；而人高转移卵巢癌细胞HO8910PM中，Lewis y抗原及FUT1基因的表达都较其亲本细胞HO8910中的表达量升高，Lewis y抗原升高1.6倍，FUT1基因升高2.13倍（P均<0.05）；在人耐药卵巢癌细胞COC1/DDP中，Lewisy抗原及FUT1基因的表达量也较其亲本细胞COC1中的表达量升高，Lewis y抗原升高1.6倍，FUT1基因升高了2.42倍。FUT1基因及lewis y抗原高表达可导致肿瘤细胞增殖和耐药及侵袭能力增强，而在高转移能力及耐药的肿瘤细胞中同样检测到有FUT1基因及Lewis y高表达。不难推断FUT1基因及Lewisy抗原在卵巢癌细胞中的表达比较普遍，可能作为共性参与肿瘤的发生、发展及预后。

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