甲状腺素对大鼠胰岛β细胞功能的影响

王 琳，房春燕，康 白，韩慧蓉

(潍坊医学院，山东潍坊261052)

甲亢患者因甲状腺激素分泌增多，葡萄糖代谢异常，升糖作用加强而出现高血糖;其代谢旺盛，胰岛素(INS)分泌相对不足，血糖升高，还可造成胰岛β细胞形态与功能损伤，导致糖耐量异常［1］。2008年，我们观察了不同剂量甲状腺素(T4)连续灌胃后，大鼠血清INS、空腹血糖(FPG)及胰腺细胞凋亡相关因子bax、bcl-2蛋白表达情况。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物、仪器及试剂 健康、清洁级SD成年大鼠60只，雌雄各半，体质量(180±20)g，购于解放军第89医院动物养殖中心。主要仪器:H-7500型透射电子显微镜(日本日立);SN-695B型智能免疫γ计数仪(上海原子核研究所);UV-1700紫外分光光度计(日本岛津)。主要试剂:左旋甲状腺素钠(德国Merck公司);INS试剂盒(北京原子能医学科学院);SABC免疫组化试剂盒、抗胰岛素抗体、浓缩型DAB显色试剂盒(武汉博士德公司)。

1.2 实验方法 将大鼠随机分为对照组［生理盐水 10 ml/(kg·d)］、低剂量组［T4100 μg/(kg·d)］、高剂量组［T4600 μg/(kg·d)］各20 只，每日9:00灌胃给药，连续用药20 d。禁食24 h后，腹腔注射3%戊巴比妥麻醉大鼠，由颈动脉取血5 ml，室温静置20 min，1 500 r/min离心15 min，分离血清置－20℃冰箱中保存。分别用放射免疫分析法、葡萄糖酶法检测血清INS、FPG。处死大鼠后迅速打开腹腔，于胰腺尾部作横断面，取出胰尾组织，用刀片快速切成1 cm×1 cm×1 cm大小的组织块;用预冷的生理盐水冲洗后，马上置于Bouin's液中固定约24 h，将固定好的组织块进行脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→贴片→烤片后，以免疫组化法染色，进行光镜样本制备。采用IpWin51C图像分析系统对染色阳性物质(棕黄色、棕褐色)行吸光光密度测定，以平均光密度值表示bax、bcl-2蛋白表达。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，计量资料以±s表示，组间比较用Dunnett法分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胰岛形态及bax、bcl-2表达 ①胰岛形态:对照组胰岛数量较多，岛形较饱满，轮廓较清晰，胰岛周边细胞数量较多，岛细胞分布均匀;低剂量组胰岛岛形不饱满，轮廓不清晰，边缘不规整，胰岛周边细胞数量较少，岛细胞分布不均匀，β细胞少于对照组(P＜0.05);高剂量组胰岛岛形不饱满，轮廓不清晰，边缘不规整，胰岛周边细胞数量较少，岛细胞分布不均匀，β细胞明显少于对照组(P＜0.05)。②bax表达:对照组未见bax表达;低剂量组可见bax表达，主要分布在闰管、腺泡处，胰岛部位表达较少，胞质为浅棕黄色;高剂量组bax表达明显，主要分布在胰岛处，腺泡及闰管处也可见到、但表达不多，胞质为深棕黄色。③bcl-2表达:对照组未见bcl-2表达;低剂量组、高剂量组bax-2未见明显表达。

2.2 各组INS、FPG、bax、bcl-2蛋白表达 见表1。

3 讨论

临床上，甲亢患者除甲亢症状外，还有FPG升高、INS降低等糖尿病症状。FPG升高可能与胰岛β细胞功能降低有关。INS升高是早期胰岛β细胞功能受损的标志;另外，外周组织葡萄糖利用降低，肝脏葡萄糖代谢异常，肠道葡萄糖吸收异常等都可引起血糖升高。葡萄糖是INS分泌的主要刺激物，长期高血糖对胰岛β细胞有毒性作用，主要包括高血糖刺激的INS分泌敏感性降低及β细胞耗竭两方面。当细胞内葡萄糖积聚超过葡萄糖分解能量时，可形成稳定的不可逆晚期糖基化终末产物，此时体内胰岛β细胞等组织含有相应受体，晚期糖基化终末产物与其受体结合后产生多种氧化应激产物［2］;由于胰岛β细胞中的抗氧化酶含量很少，故易受氧化应激产物的损伤。本实验结果显示，大鼠采用T4灌胃，其INS降低，FPG升高;说明长期大剂量应用T4可影响机体的糖代谢，使FPG升高，INS降低。

表1 各组 INS、FPG、bax、bcl-2 蛋白表达(±s)

表1 各组 INS、FPG、bax、bcl-2 蛋白表达(±s)

注:与对照组比较，*P ＜0.05

组别 n INS(mIU/L) FPG(mmol/L)bax bcl-2对照组 20 24.90 ±4.95 4.15 ±0.59 0.000 1 ±0.001 2 0.00012 ±0.001 189低剂量组 20 26.70 ±8.32 4.33 ±0.31 0.001 0 ±0.002 6* 0.000 19 ±0.002 358高剂量组 20 18.40 ±3.44* 4.86 ±0.31* 0.012 4 ±0.011 1*0.000 26 ±0.004 516

bax与bcl-2同属bcl-2基因家族，二者之间可能存在平衡关系，二者表达的蛋白产物可形成同源二聚体 bcl-2/bcl-2、bax/bax或异源二聚体 bcl-2/bax，并抑制或促进凋亡发生［3］。bax、bcl-2 因子任一表达增多或降低都可使其平衡异常，出现不同的细胞凋亡结果。凋亡因子bax大量表达时，提示胰岛β细胞有不同程度的损伤;胰岛β细胞损伤势必引起INS分泌减少，使FPG升高。本实验结果表明，T4低剂量组、高剂量组bax蛋白表达均增多，而其bcl-2未见明显表达，提示大剂量T4可引起胰岛β细胞凋亡。由此可推断，长期大剂量应用T4可使胰岛β细胞凋亡，此可为临床用药及疾病的诊治提供理论依据。

［1］Liu D，Darville M，Eizirik DL.Double-stranded ribonucleic acid(RNA)induces beta-cell Fas messenger RNA expression and increases cytokine-induced beta-cell apoptosis［J］.Endocrinology，2003，142(6):2593-2599.

［2］Kim WH，Lee JW，Suh YH，et al.Exposure to chronic high glucose induces beta-cell apoptosis through decreased interaction of glucokinase with mitochondria:down regulation of glucokinase in pancreatic beta-cell［J］.Diabetes，2005，54(9):2602-2611.

［3］Rawat S，Gray C，Johnson TS，et al.Apoptosis and expression of bcl-2 and bax in cyclosporine-induced experimental renal fibrosis［J］.Transplant Proc，2003，35(1):187-188.