脾酪氨酸激酶蛋白在胃癌组织中的表达及意义

刘泓基，彭 艳，廖 玲，薄晓通，苗苏州

(1桂林医学院附属医院，广西桂林 541001;2广西师范大学;3南京市第二人民医院)

近年研究发现，脾酪氨酸激酶(Syk)表达缺失可能与乳腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、胆囊癌等形成和转移有关，但鲜见 Syk蛋白在胃癌组织中表达的报道。2010年 9～12月，我们对 Syk蛋白与胃癌发生、发展及其恶性生物学行为的关系进行了相关研究。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择在桂林医学院附属医院行手术治疗且资料保存完整的 38例胃癌患者的病灶切除组织标本。其中，男 22例、女 16例，年龄 38～76岁，术前均未行放疗、化疗及生物制剂治疗。根据2009年国际抗癌联盟及美国肿瘤联合会联合制定的 TNM分期标准进行临床分期，T1+T2期 16例、T3+T4期 22例。另随机选择癌旁组织(距瘤块组织 5 cm以上)16例组织标本作为对照。

1.2 方法 浓缩型一抗购自美国 BG公司(型号:P04S066785E)，即用型二抗试剂盒购自中杉金桥(美国 GBI公司，型号:PV-9005)检测 Syk蛋白表达。蜡块 4μm连续切片，53℃孵育 60 min，切片常规脱蜡和水化后，先用 PBS冲洗 3次 ×3 min，再用柠檬酸钠加热法对抗原进行修复2 min。室温下，切片置 3%过氧化氢中 10 min，PBS冲洗 3次;10%血清孵育 10 min，加一抗室温下孵育 60 min，PBS冲洗3次 ×5 min;加中杉金桥二抗试剂按 1∶200稀释孵育 10～15 min，PBS冲洗 3次;加新鲜配制二氨基联苯溶液显色，显微镜下观察 1～3 min。自来水冲洗后加入苏木素复染，再用 PBS冲洗返蓝。切片经梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察、照相。每批染色均设阴性空白对照，以PBS代替一抗作阴性对照，用人 Burkitt淋巴瘤细胞作阳性对照。结果判断:以细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性，每例切片至少计数 10个 400倍视野，细胞数所占比例分为:＜10%(-)，10%～29%(+)，30%～50%(++)，＞50%(+++)。染色强度判定:不着色 (-)，浅棕黄色 (+)，棕黄色 (++)，棕褐色(+++)。综合阳性细胞数和染色强度对染色结果进行分析。

1.3 统计学方法 采用 SPSS17.0统计软件，计数资料比较采用 χ2检验，计量资料比较采用 t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Syk蛋白在胃癌及癌旁组织的表达情况 胃癌及癌旁组织中 Syk蛋白阳性分别为 8例(21.05%)、14例(87.50%)，两者比较差异有统计学意义(χ2=20.59，P＜0.01)。

2.2 Syk蛋白在胃癌组织的表达与临床病理参数的关系 见表1。

3 讨论

Syk基因最早由日本学者 1991年从猪脾 cDNA克隆出来的，该基因位于人类染色体 9q22，分子量72 kD，由 629个氨基酸组成。Syk是目前发现的唯一有抑癌作用的蛋白酪氨酸激酶。Coopman等首先发现乳腺癌细胞中有 Syk表达缺失现象，此后大量研究表明，在多种肿瘤发病过程中存在 Syk表达缺失现象[1～4]。

表1 Syk蛋白的表达与胃癌临床病理参数的关系

目前认为 Syk可能通过以下机制影响肿瘤发生:影响细胞迁移;抑制细胞分裂和增殖;干预某些细胞因子的分泌;抑制肿瘤成瘤能力和转移。胡青钢等[5]发现，Syk的表达与胃癌的微血管密度呈明显的负相关，提示 Syk作为一种候选抑癌基因，可能通过影响血管的生成而抑制肿瘤生长和转移。Carter等[6]研究证实，Syk可通过抑制肿瘤细胞分泌肿瘤相关细胞因子抑制肿瘤的生长与转移。刘月仙等[7]研究发现，有淋巴结转移的胃癌组织 Syk基因甲基化率显著高于无淋巴结转移组，表明 Syk基因的甲基化与胃癌生成及淋巴结转移相关[8]。Wang等[9]研究发现 Syk基因甲基化导致在胃癌中存在Syk基因失表达现象，表明 Syk启动子甲基化与胃癌形成和转移有关。

Syk基因在胃癌中的表达报道不一致，有文献报道 Syk在胃癌中表达阳性率为 5.1%～41.2%，本研究结果与文献报道一致。本研究表明，Syk蛋白在胃癌组织中的表达强度明显低于正常癌旁组织(P＜0.01)，且在肿瘤组织中 Syk蛋白表达强度与浆膜浸润、TNM分期、淋巴结转移及远处转移等有密切关系(P＜0.05)，而与年龄、性别、组织学类型无关。大量研究表明，Syk有抑制肿瘤发生和转移的功能。在本课题的后续研究中，在扩大样本量的基础上，应用荧光定量 PCR和甲基化 PCR法在基因水平检测 Syk表达与胃癌恶性生物学行为的关系，并应用 FISH检测 Syk基因扩增和基因突变情况，进一步探索胃癌中 Syk失表达的机制，并联合检测 HER-2及 EGFR基因，从分子和细胞生物学角度探讨多基因与胃癌发生及转移的关系，为进一步寻找胃癌早期诊断的分子生物标志及早期分子治疗的靶标提供实验依据和理论依据。

总之，Syk蛋白在胃癌组织中呈现明显表达缺失，且与其浆膜浸润、TNM分期、淋巴结转移及远处转移倾向相关。Syk在胃癌的发生、发展及其防治中的作用机制有待进一步研究。

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[3]Yuan Y，Liu H，Sahin A，et al.Reactivation of Syk expression by inhibition of DNA methylation suppressesbreastcancer cell invasiveness[J].Int JCancer，2005，113(4):654-659.

[4]Sada K，Takano T，Yanagi S，et al.Structure and function of Syk protein tyrosine kinase[J].JBiochem，2001，130(2):177-186.

[5]胡青钢，刘小卫，郑启昌.酪氨酸激酶 Syk在肝癌中的表达及与血管生成的关系[J].中华肝胆外科杂志，2007，13(7):463-465.

[6]Carter B，Niu G，Ward D，et al.Mechanisms of HER-2 induced endothelial cell retraction[J].Ann Surg Oncol，2007，14(10):2971-2978.

[7]刘月仙，丁永斌，杨力，等.候选抑癌基因 Syk启动子甲基化与胃癌转移相关[J].南京医科大学报，2006，26(3):169-171.

[8]Gatalica Z，Bing Z.Syk tyrosine kinase expression during multistep mammary carcinogenesis[J].Croat Med J，2005，46(3):372-376.

[9]Wang S，Ding YB，Chen GY，et al.Hypermethylation of Syk gene in promoter region associated with oncogenesis and metastasis of gastric carcinoma[J].World J Gastroenterol，2004，10(12):1815-1818.