HPCE法同时测定新疆药桑叶中芦丁、异槲皮苷、槲皮素与绿原酸的含量

2011-05-23阿合买提江马晓丽古力包斯坦巴拉提新疆医科大学药学院化学教研室乌鲁木齐市830011

中国药房 2011年23期

孙莲，阿合买提江，马晓丽，古力包斯坦·巴拉提（新疆医科大学药学院化学教研室，乌鲁木齐市 830011）

桑叶始载于《神农本草经》，为桑科植物桑Morus alba L.的干燥叶。本品性寒，味甘、苦，具有疏散风热、清肺润燥、清肝明目、滋阴补血、益肝通气、降压利尿之功能，《神农本草经》称其为“神仙叶”，是常用中药之一[1]。药桑是新疆独特的品种之一，是国内唯一的花性染色体倍数为22倍体的桑品种，是新疆目前桑品种分类鉴定中唯一的黑桑（M.nigra Linn.）种，药用价值极高。现代药理研究证明，桑叶具有降血糖、降血压、抗菌和抗病毒等多种药理活性，能预防和治疗糖尿病[2，3]。桑叶中的黄酮类成分有芦丁、槲皮素、异槲皮苷等，为桑叶中主要的功效成分，具有很好的降血糖、降血脂、抗氧化、抗肿瘤[4]和抗菌作用，因此分析测定桑叶中黄酮类成分对开发利用新疆的桑叶资源具有重要意义。已报道的关于对桑叶中黄酮类成分的分析方法主要有分光光度法和高效液相色谱法[5，6]，利用高效毛细管电泳（HPCE）法同时测定桑叶中芦丁、槲皮素、异槲皮苷与绿原酸含量的研究尚未见报道[7]。因此，笔者采用HPCE法同时测定新疆药桑叶中上述4种主要功效成分的含量，以为新疆药桑的开发利用提供基础研究数据。

1 仪器与试药

P/ACETMDQ型HPCE仪（压力进样，二极管阵列检测器，检测波长为254 nm，用karat 32.0软件控制仪器操作和数据采集）；超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

槲皮素（批号：10081-9905）、芦丁（批号：10080-9705）、绿原酸（批号：110753-200413）、异槲皮苷（批号：1106634）对照品均由中国药品生物制品检定所提供；甲醇、NaOH均为分析纯，硼砂为优级纯；药桑叶采自新疆喀什，经新疆医科大学药学院天然药物教研室帕丽达·阿不力孜教授鉴定为真品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：毛细管柱（50 cm×75 μm，id）；电泳缓冲液：50 mmol·L-1硼砂溶液（pH 9.6）；柱温：25 ℃；电压：20 kV；检测波长：254 nm。毛细管柱使用前用0.1 mol·L-1NaOH、水和电泳缓冲液分别冲洗1、2、3 min，在此色谱条件下测得混合对照品与供试品溶液的色谱图见图1。

2.2 供试品溶液的制备

精密称取过40目筛的药桑叶粉末1.0 g，置具塞三角瓶中，加甲醇20 mL，60℃超声提取30 min，提取2次，过滤，合并滤液，置于50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为供试品溶液。用时过0.45 μm滤膜。

2.3 对照品贮备液的制备

图1 高效毛细管电泳图A.混合对照品；B.桑叶供试品；1.芦丁；2.异槲皮苷；3.绿原酸；4.槲皮素Fig 1 HPCEA.mixed control；B.M.nigra sample；1.rutin；2.isoquercitrin；3.chlorogenic acid；4.quercetin

分别精密称取干燥至恒重的芦丁、槲皮素、异槲皮苷与绿原酸对照品，依次为8.8、7.6、5.7、6.6 mg，置10 mL容量瓶中，加少量甲醇使之溶解，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，配成质量浓度分别为0.88（芦丁）、0.76（槲皮素）、0.57（异槲皮苷）、0.66（绿原酸）mg·mL-1的对照品贮备液，4℃贮藏，备用。

2.4 标准曲线的制备

精密吸取芦丁、槲皮素、异槲皮苷与绿原酸对照品贮备液各1.0 mL，置于25 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配成混合对照品溶液。分别进样5、10、15、20、25 μL，照上述色谱条件测定峰面积。以峰面积积分值（Y）为纵坐标，对照品溶液的浓度（X）为横坐标，制备标准曲线。4种黄酮类成分的标准曲线、相关系数与线性范围见表1。

表1 4种黄酮类成分的标准曲线、相关系数与线性范围Tab 1 Standard curves，correlation coefficient and linear range of 4 kinds of total flavonoids

2.5 精密度试验

在上述色谱条件下，将混合对照品溶液连续进样5次，每次20 μL，测定4种黄酮类成分的峰面积。结果，芦丁、异槲皮苷、绿原酸与槲皮素峰面积的RSD分别为1.9%、2.1%、2.6%、2.9%（n＝5），表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

称取药桑叶粉末适量，共6份，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，进样20 μL，测定4种黄酮类成分的峰面积，代入回归方程计算含量。结果，芦丁、异槲皮苷、绿原酸与槲皮素含量的RSD分别为1.7%、2.8%、3.6%、1.6%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取供试品溶液，分别于0、2、8、12、24 h进样20 μL，测定4种黄酮类成分的峰面积。结果，芦丁、异槲皮苷、绿原酸与槲皮素峰面积的RSD分别为1.6%、3.0%、3.7%、2.6%（n＝5），表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知芦丁、槲皮素、绿原酸和异槲皮苷含量的药桑叶粉末适量，共12份，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，其中3份为本底样，另9份中，每3份分别加低、中、高浓度的混合对照品溶液，进样20 μL，测定4种黄酮类成分的峰面积，代入回归方程计算芦丁、槲皮素、绿原酸和异槲皮苷的含量及平均回收率，结果见表2。

2.9 样品含量测定

表2 加样回收率试验结果（n＝9）Tab 2 Results of recovery tests（n＝9）

取5批药桑叶粉末适量，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，进样20 μL，测定4种黄酮类成分的峰面积，代入回归方程计算含量（n＝5）。结果，芦丁、异槲皮苷、绿原酸、槲皮素的含量分别为0.72、0.70、2.15、0.29 mg·g-1，RSD分别为3.2%、2.8%、2.1%、1.8%。

3 讨论

3.1 缓冲液体系及浓度的选择

试验比较了50mmol·L-1NaH2PO4溶液、50 mmol·L-1NaH2PO4-甲醇、50 mmol·L-1硼砂溶液3种缓冲液体系，考察了各缓冲液体系对分离效果的影响。结果表明，50 mmol·L-1硼砂溶液为缓冲液体系时，色谱峰尖锐且分离效果最好。试验同时考察了硼砂溶液的浓度（20、30、40、50、60 mmol·L-1），发现其浓度为50 mmol·L-1时各峰分离效果最好。故本试验选择50 mmol·L-1硼砂溶液为电泳缓冲溶液。

3.2 缓冲液体系pH值的选择

缓冲液体系pH值是影响分离度的重要因素。试验在固定分离电压与进样时间的前提下，比较了缓冲液pH值为7.0、8.0、9.0、10.0、11.0时对分离度的影响。结果发现，当pH值在低于8.0与高于10.0时，分离效果较差，因此确定缓冲液最佳pH值范围在8.0～10.0内。再在此范围内每隔0.2个单位进行系统考察，结果表明当缓冲液的pH值为9.6时，芦丁、槲皮素、异槲皮苷与绿原酸4种成分的峰形最好，且与其他物质有很好的分离，故本试验选择缓冲液体系的最佳pH值为9.6。

3.3 分离电压的选择

试验比较了分离电压分别为20、25、30、35 kV时对分离度的影响。结果发现，当分离电压低于20 kV时，迁移时间延后且峰形有拖尾现象；当分离电压高于25 kV时，迁移时间提前且分离效果不好；只有当分离电压为20 kV时，芦丁、槲皮素、异槲皮苷与绿原酸能得到较好的分离，且迁移时间与峰面积适中，故本试验选择分离电压为20 kV。

3.4 进样时间的选择

进样时间是影响供试品分离效果的关键因素，进样时间过短将导致灵敏度低，进样时间过长将使毛细管负载增加，并使峰形加宽。本试验采用重力进样，在进样高度为10 cm时依次考察了进样时间5、15、20、25、30、35、40 s对供试品中芦丁、槲皮素、异槲皮苷与绿原酸的峰面积及迁移时间的影响，发现5 s为最佳进样时间。