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布渣叶抗内毒素和急性毒性实验研究Δ

2011-05-23梅全喜戴卫波范文昌曾聪彦钟希文广州中医药大学附属中山医院中山市528400

中国药房 2011年23期
关键词:水提物内毒素小鼠

梅全喜,戴卫波,范文昌,曾聪彦,钟希文(广州中医药大学附属中山医院,中山市 528400)

布渣叶为椴树科植物破布叶Microcos paniculata L.的干燥叶,最早见于清·何克谏所著的岭南本草书籍《生草药性备要》(公元1717年),该书载其:“味酸,性平,无毒,解一切蛊胀,清黄气,消热毒。[1]”《本草纲目拾遗》(公元1765年)引《广东通志》云:“从肇庆新桥而上,人烟寥落,山路多歧,乃三县交界之区。舟人及此险地,即燃梦香,客皆酣卧昏迷,遂被启,易赀财以砾块,封识宛然,若枕间置水一盂,则迷药皆涣散矣,又有药名破布叶,可解。行者歌曰:身无破布叶,莫上梦香船。”又引《肇庆志》曰:“破布叶出阳江阳春恩平,状如掌而绿,岭南舟人多用香烟及毒水迷闷过客,以此草煎汤服之,立解。[2]”其后的《岭南草药志》、《陆川本草》及两广地区的中草药手册对此均有记载。自古以来,布渣叶就在岭南地区的民间广泛应用,民间常用布渣叶煎茶作夏季饮料,有解渴、开胃作用[3],并认为其无毒。临床上亦常用本品治疗消化系统类疾病,均未见有毒副作用报道。然布渣叶的毒性如何,一直缺乏实验研究验证,本研究进行急性毒性和抗内毒素实验,对布渣叶急性毒性和解毒作用进行研究,以期为本品安全、合理使用提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

BS224S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

1.2 试药

布渣叶,购于广东广弘药材有限公司,经广东省中山市药检所鉴定为真品;地塞米松(上海易利生物科技有限公司,批号:20100418);大肠杆菌O55B5内毒素(上海申索试剂有限公司);生理盐水、蒸馏水均由广州中医药大学附属中山医院制剂室自制。

1.3 动物

SPF级昆明种小鼠,♀♂兼半,体重(20±2)g,由广东省医学实验动物中心提供(动物合格证号:SCXK(粤)2008-0002)。根据实验性质和性别分笼喂养,自由采食饮水。

2 方法与结果

2.1 统计学方法

抗内毒素实验数据用Fisher’s exact test取双侧检验值;急性毒性实验数据用SPSS13.0概率单位法统计分析(Probit Analysis);P<0.05为有显著性统计学差异,P<0.01为有非常显著性统计学差异。

2.2 抗内毒素实验

2.2.1 布渣叶水提物的制备 取布渣叶粗粉1 kg,加水浸泡1 h,煎提2次,过滤,合并滤液,浓缩成500 mL,即2 g(生药)·mL-1。加防腐剂,贮藏于冰箱中,临用前配制成所需浓度。

2.2.2 实验方法 取小鼠60只,♀♂兼半。随机均分为6组,即空白对照(等容量生理盐水)、模型(等容量生理盐水)和布渣叶水提物高、中、低剂量(23.4、11.7、5.58 g·kg-1)组,ig给药,连续7 d;地塞米松(0.02 g·kg-1)组于给药末次当日im给药。于末次给药后1.5 h,除空白对照组ip等容量的生理盐水外,其余各组小鼠均ip大肠杆菌O55B5内毒素60 mg·kg-1,观察并记录各组小鼠在注射内毒素或生理盐水后3 h内的形态变化(是否出现耸毛、发抖、蜷缩、拒食、睑膜充血、舌质偏出,耳缘及皮下是否出现出血、斑点)和72 h内的生存状况。布渣叶水提物抗内毒素作用见表1。

结果,空白对照组小鼠活动自如。模型和各用药组ip大肠杆菌O55B5内毒素1 h内,各组小鼠均活动自如。12 h后布渣叶水提物低剂量组、模型组有部分小鼠死亡,模型组、地塞米松组、布渣叶水提物高、中、低剂量组小鼠均出现耸毛、烦躁不安、颤抖、蜷缩及眼睑充血等现象。注射后的第3天,布渣叶水提物低剂量组存活小鼠状态均有好转,模型组小鼠还是出现烦躁不安、颤抖、蜷缩等症状,地塞米松组小鼠活动自如。布渣叶水提物高、中剂量组与模型组比较,对减少ip大肠杆菌O55B5内毒素所致小鼠死亡数有显著性意义(P<0.05),其死亡率分别为20%、20%。结果表明,布渣叶水提液具有抗内毒素休克死亡作用。

表1 布渣叶水提物抗内毒素作用Tab 1 Anti-endotoxic effects of aqueous extract of F.microcotis

2.3 急性毒性实验

2.3.1 药物的制备 布渣叶粗粉1350 g,布口袋包扎后用冷水浸泡1 h,水量以浸没药材为度。放入提取罐中煎煮3次,每次1 h。合并提取液,4℃冰箱中冷藏24 h,过滤。滤液浓缩至220 mL,即6.136 g·mL-1,冷藏,备用,用时稀释至所需浓度。

2.3.2 预实验 小鼠每组4只,♀♂兼半,以药物的最大ig浓度(药物能顺利通过ig针头的最大药物浓度)为起始浓度,1∶0.5浓度梯度往下稀释,ig体积均为35 mL·kg-1,ig给药前禁食不禁水约12 h,药后正常饲养,密切观察动物状况,摸索出药物最大致死量(Dm)和药物最小致死量(Dn)。经实验表明,布渣叶水提物最大ig浓度为214.76 g·kg-1,Dm=150.33 g·kg-1,Dn=47.25 g·kg-1。

2.3.3 正式实验[4]在Dm和Dn间以1∶0.75梯度稀释,分为5组,每组10只,♀♂兼半,ig体积均为35 mL·kg-1,ig给药前禁食不禁水约12 h,药后正常饲养,连续7 d密切观察小鼠状况并纪录。布渣叶水提物急性毒性实验结果见表2。

表2 布渣叶水提物急性毒性实验结果Tab 2 Acute toxic experiment of aqueous extract of F.microcotis

经SPSS13.0概率单位法统计分析(Probit Analysis),布渣叶小鼠半数致死量(LD50)=91.76 g·kg-1,此LD50的95%可信区间为77.28~108.85 g·kg-1。经解剖观察,死亡小鼠的心、肝、肾、脾等内脏器官肉眼观察未见病理变化,而部分死亡小鼠仅见胃有胀气现象。

3 讨论

内毒素是革兰阴性细菌细胞壁外膜的组成成分,由细菌死亡后细胞壁裂解释放。内毒素主要成分为脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS),是细菌致病的主要物质,在多种危急重症中起着重要作用,如发热反应、感染性休克、白细胞反应,多器官功能衰竭及弥散性血管内凝血等。内毒素还有免疫激活作用,可引起机体免疫损伤。近年来,已经发现许多中药具有抗内毒素作用,如大青叶、甘草、金银花、连翘等。其作用机制有清除或灭活内毒素,减弱或消除内毒素诱发活性因子的损伤及对脏器组织细胞的保护作用[5]。本研究结果表明,布渣叶水提物可显著减少内毒素所致动物死亡数,表现出良好的抗内毒素休克死亡作用,这正与布渣叶自古以来就当作清热解毒良剂相印证。另有研究表明,本品有清除自由基[6]、抗衰老和延长缺氧鼠存活时间等作用[7]。由此提示,本品抗内毒素作用机制可能与减弱或消除内毒素诱发的活性因子的损伤及对脏器组织细胞的保护作用有关,具体有待于进一步研究。

布渣叶毒性方面,自《生草药性备要》最早载其“无毒”以来,之后书籍也均载其“无毒”或未提及,文献中也未见有关其毒性或不良反应的报道。布渣叶也是王老吉等多个凉茶配方的组成药味,在《十余年来王老吉凉茶,食品安全毒理学评价结果的报告》一文中,报道了布渣叶提取液和布渣叶浸膏的小鼠急性毒性LD50>21.5 g·kg-1,进行小鼠骨髓微核实验、小鼠精子畸形实验和Ames实验结果均为阴性,进行的大鼠致畸实验结果也为阴性,进行的大鼠90 d急性毒性实验结果也表明各项指标正常。本研究中,布渣叶水提物小鼠的急性毒性LD50为91.76 g·kg-1,2010年版《中国药典》载布渣叶用量为15~30 g,如以成人体重70 kg、日服用剂量30 g计算,则此LD50值相当于临床剂量的214倍。有文献认为,LD50>10.00 g·kg-1则可确认为实际无毒物[8]。由此可认为布渣叶在2010年版《中国药典》推荐剂量下使用是安全的。而对死亡和存活小鼠的心、肝、肾、脾等内脏器官解剖,肉眼观察未见病理变化,仅部分死亡动物胃有见胀气现象。本实验由于受经费限制未能从病理方面对死亡原因进行探讨。

[1]清·何克谏著,朱晓光点注.生草药性备要(岭南本草古籍3种)[M].北京:中国医药科技出版社,1999:32.

[2]清·赵学敏.本草纲目拾遗[M].北京:中国中医药出版社,1998:240.

[3]曾聪彦,梅全喜.布渣叶的药用历史及现代研究概述[J].中国药房,2008,19(增刊):25.

[4]陈 奇.中药药理研究方法学[M].北京:人民卫生出版社,1993:113.

[5]孙耀光.中药抗内毒素的作用及其机制[J].现代中医药,2004,24(6):40.

[6]潘天玲,李坤平,林赞菲,等.不同产地布渣叶总黄酮含量及其清除自由基活性研究[J].广东药学院学报,2009,25(5):452.

[7]曾聪彦,梅全喜,戴卫波.布渣叶药理作用研究的新进展[J].中华中医药学刊,2010,28(9):1927.

[8]李建华.中药类急性毒性技术法与LD50值的分级[J].中草药,1994,25(7):388.

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