白及多糖对溃疡性结肠炎的作用研究

2011-05-23柯昌毅赵春景重庆市第三人民医院重庆市400014重庆医科大学附属第二医院重庆市400010

中国药房 2011年23期

柯昌毅，赵春景（1.重庆市第三人民医院，重庆市 400014；.重庆医科大学附属第二医院，重庆市 400010）

溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）是一种慢性非特异性肠道炎症性疾病，临床主要表现为腹痛、腹泻、黏液血便等症状[1]。近年来，我国UC发病呈持续升高趋势。UC临床治疗以激素、水杨酸制剂和免疫抑制剂等为主，但疗效不够满意，且长期应用有较多的不良反应。

白及为兰科植物白及（Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.）的块茎，味苦、甘、涩，性微寒，具有收敛止血、清热利湿、消肿生肌之功效，临床上用于治疗咳血、吐血、溃疡病出血、外伤出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂以及烧伤、烫伤等。白及多糖（Bletilla striata polysaccharides，BSPS）是从白及药材中经一定工艺提取所得的多糖，由葡萄糖和甘露糖（1∶4）以β-糖苷键聚合而成，平均分子量为65000～150000 kDa，具有抗炎、促凝血、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化等生物学活性[2]。临床研究提示，白及灌肠液可有效缓解UC临床症状[3]，但其作用机制目前尚未见相关报道。本研究拟采用恶唑酮（Oxazolone，OXZ）诱导复制小鼠UC模型，初步探讨白及多糖对UC的作用及其机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

3K30型超低温离心机（德国Sigma公司）；550型酶标仪（美国BioRad公司）。

1.2 试药

白及（重庆中药饮片厂，批号：55100003）由笔者鉴定为真品；BSPS为笔者自制（由白芨块茎水提醇沉并精制所得，未分级）；OXZ（美国Sigma公司）；柳氮磺胺吡啶（SASP，山西同达药业有限公司，批号：100802）；白细胞介素（IL）-10、肿瘤坏死因子（TNF）-α、核转录因子（NF）-κB酶联免疫（ELISA）试剂盒均购自天津康尔克生物科技有限公司。

1.3 动物

Ⅰ级纯种NIH小鼠，♂，体重24～28 g，由重庆医科大学实验动物中心提供（动物合格证号：SCXK（渝）20020001）。

2 方法

2.1 复制UC模型

参考Heller F等[4]方法进行。将小鼠暴露腹部皮肤涂抹3%OXZ（100%乙醇溶剂）0.2 mL，第2天重复1次，5 d后经肛门缓慢注入0.8%OXZ（50%乙醇溶剂）0.15 mL；对照小鼠仅于腹部涂抹生理盐水，5 d后以生理盐水0.15 mL灌肠。

2.2 分组和给药

小鼠随机分为对照（等容生理盐水）、模型（等容生理盐水）、SASP（370 mg·kg-1）和BSPS高、中、低剂量（320、160、80 mg·kg-1）组。ig给药，每天1次，连续10 d。末次给药24 h后处死小鼠，检测相应指标。

2.3 疾病活动指数（DAI）评分

分别于灌肠后3 d和末次灌胃后，按Okayasu I等[5]标准进行DAI评分。

2.4 结肠损伤评分

分离距肛门2 cm以上结肠6～8 cm，称重后沿肠系膜纵轴剪开，以生理盐水冲洗，并将肠黏膜向上平铺于蜡板上，参照Luk HH等[6]标准进行结肠组织大体评分；制作HE染色病理切片，参照Ekstrom GM等[7]标准进行结肠组织病理评分。

2.5 结肠指数测定

根据公式计算结肠指数：结肠指数＝结肠重量/体重×100%。

2.6 ELISA法检测IL-10、TNF-α、NF-κB水平

制备10%结肠组织匀浆，4℃下，4000 r·min-1离心20 min，保留上清液，备用。按照ELISA试剂盒说明书分别测定IL-10、TNF-α、NF-κB水平。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 BSPS对模型小鼠DAI的影响

灌肠3 d后，模型组和BSPS组小鼠出现体重下降、腹泻和肉眼血便，其DAI显著高于对照组（P＜0.01）；ig给药10 d后，SASP和BSPS高、中剂量组DAI较模型组显著减低（P＜0.01或P＜0.05）。白及多糖对模型小鼠DAI的影响见表1。

表1 白及多糖对模型小鼠DAI的影响（±s，n＝5）Tab 1 Effect of B.striata polysaccharides on DAI in model mice（±s，n ＝5）

与对照组比较：＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

组别对照组模型组SASP组BSPS低剂量组BSPS中剂量组BSPS高剂量组3 d 0±03.02±0.28＊3.11±0.222.94±0.183.07±0.243.13±0.2110 d 0±03.15±0.23＊2.64±0.19#2.87±0.172.69±0.11#2.44±0.16##

3.2 BSPS对模型小鼠结肠组织大体和病理评分的影响

模型组结肠黏膜可见明显充血、水肿、糜烂和溃疡，溃疡呈圆形或椭圆形；病理学检查可见炎性细胞浸润，结肠黏膜腺体破坏、隐窝消失、上皮细胞脱落形成浅溃疡，结肠组织大体评分和病理组织学评分显著高于对照组（P＜0.01）；SASP和BSPS高、中剂量组溃疡数量显著减少，充血水肿显著减轻，伴少量炎性细胞浸润，结肠组织大体评分和病理组织学评分较模型组显著下降（P＜0.01或P＜0.05）。白及多糖对模型小鼠结肠组织大体和病理评分的影响见表2。

表2 白及多糖对模型小鼠结肠组织大体和病理评分的影响（±s，n＝5）Tab 2 Effect of B.striata polysaccharides on tissular general score and histological score in model mice（±s，n＝5）

与对照组比较：＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

组别对照组模型组SASP组BSPS低剂量组BSPS中剂量组BSPS高剂量组病理评分1.21±0.4411.53±1.62＊9.21±0.78#10.67±1.858.93±0.69#6.46±0.45##大体评分0±07.73±0.71＊5.48±0.46#6.69±0.875.17±0.42#4.37±0.58##

3.3 BSPS对模型小鼠结肠指数的影响

与对照组比较，模型组结肠指数显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，SASP和BSPS高、中剂量组结肠指数显著降低（P＜0.01或P＜0.05）。白及多糖对模型小鼠结肠指数的影响见表3。

3.4 BSPS对模型小鼠结肠IL-10、TNF-α和NF-κB水平的影响

与对照组比较，模型组IL-10显著降低，TNF-α和NF-κB均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，SASP和BSPS高、中剂量组IL-10显著升高，TNF-α和NF-κB显著降低（P＜0.01或P＜0.05）。白及多糖对模型小鼠IL-10、TNF-α和NF-κB水平的影响见表4。

表3 白及多糖对模型小鼠结肠指数的影响（±s，n＝5）Tab 3 Effect of B.striata polysaccharides on colon indices in model mice（±s，n＝5）

与对照组比较：＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

分组对照组模型组SASP组BSPS低剂量组BSPS中剂量组BSPS高剂量组1.92±0.203.30±0.43＊2.83±0.31#3.17±0.332.74±0.37#2.36±0.28##结肠指数

表4 白及多糖对模型小鼠IL-10、TNF-α和NF-κB水平的影响（±s，n＝5）Tab 4 Effect of B.striata polysaccharides on IL-10，TNF-α and NF-κB in model mice（±s，n＝5）

与对照组比较：＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

NF-κB/ng·L-1 277.05±56.391106.47±185.26＊787.22±121.81#1072.01±179.49722.11±110.90#667.79±101.81##分组对照组模型组SASP组BSPS低剂量组BSPS中剂量组BSPS高剂量组IL-10/pg·mL-1 201.32±27.03108.17±16.21＊102.09±21.18#122.51±16.11157.44±20.75#176.29±24.61#TNF-α/ng·L-1 97.65±16.75332.04±36.90＊179.25±30.71#309.57±33.85167.23±28.66#138.48±23.73##

4 讨论

溃疡性结肠炎病变主要位于结肠黏膜和黏膜下层，多累及直肠和远端结肠[8]，肠道持续炎症损伤是UC的重要病理改变，并以大量的炎性细胞浸润肠壁和持续活化为特征。研究认为，在遗传、环境和病原微生物等因素综合作用下，机体免疫系统激活，细胞因子网络平衡破坏，导致炎性细胞活化，多种炎症因子异常释放是UC发病的主要机制。

TNF-α是由单核巨噬细产生，对免疫炎症反应均有重要调节作用的炎症介质。研究发现，TNF-α可诱导结肠上皮细胞凋亡，促进UC的发生[9]。IL-10是具有抑制单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和T细胞激活，抑制IL-6、IL-8和TNF-a等促炎症因子的释放，在调节肠道免疫平衡中起着重要调节作用的抗炎因子，对UC具有保护作用[10]。NF-κB是一种重要的核转录因子，参与调控多种重要免疫因子的表达，在调节机体免疫反应中起重要作用。NF-κB可通过上调IL-6，促进肠上皮细胞的异型增生和免疫细胞炎症介质释放[11]。本研究结果表明，模型组小鼠在出现明显的UC症状和病理形态学损伤的同时，伴有促炎介质TNF-α和NF-κB显著升高，抗炎介质IL-10显著降低，提示炎症因子平衡失调和免疫异常是UC重要的病理生理基础，与既往报道一致。

本研究中，BSPS可有效降低DAI、结肠损伤评分和结肠指数，缓解UC病理损伤和症状，抑制TNF-α和NF-κB异常升高，其活性与SASP相似，且具有剂量依赖性。与SASP比较，BSPS还能剂量依赖性上调IL-10水平，提示BSPS对炎症平衡的调节作用优于SASP。此外，据文献[11]报道，长期大量使用SASP可出现溶血性贫血、红斑狼疮综合征、男性不孕等多种严重不良反应，而BSPS为白芨提取制备的纯天然高分子化合物，具有自身降解性、无刺激、无毒副作用等特点。因此，BSPS具有抗炎和免疫调节作用较SASP更强、更全面，毒副作用更低的优势。

综上所述，BSPS具有促进UC肠黏膜修复、抑制机体炎症和恢复免疫平衡的作用，其作用机制可能与抑制TNF-α和NF-κB，上调IL-10水平有关。

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