马来酸桂哌齐特注射液细菌内毒素检查方法的建立

王宗春，罗丽萍，黄砚青（武汉大学人民医院药学部，武汉市 430060）

马来酸桂哌齐特注射液为无色澄明液体，临床主要用于治疗脑血管疾病（如脑动脉硬化、一过性脑缺血发作、脑血栓形成等）、心血管疾病（如冠心病、心绞痛、心肌梗死等）及外周血管性疾病。静脉用注射剂可以通过热原检查法（家兔法）判断其所含热原的限度是否符合规定，但是该法存在操作烦琐、费时费力及影响因素较多等缺点，而细菌内毒素检查法具有灵敏度高、简便易行及重现性好等优势，已被各国药典所采用。目前尚未有马来酸桂哌齐特注射液细菌内毒素检查的文献报道，笔者参照《中国药典》2010年版（二部）[1]以及《中国药品检验标准操作规范》2005年版[2]细菌内毒素检查法，建立了本品的细菌内毒素检查方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

恒温水浴箱（江苏南通嘉程仪器有限公司）；微量取液器（上海金林生化试剂仪器厂，规格：50～250µL）；SW-80A型旋涡混合器（上海医科大学仪器厂）；细菌内毒素检查用具（厦门鲎试剂实验厂）。

1.2 试药

马来酸桂哌齐特注射液（北京四环制药有限公司，批号：20091210、20100123、20100309，规格：80 mg∶2 mL）；细菌内毒素检查用水（BET水，厦门鲎试剂实验厂，批号：091107）；细菌内毒素工作标准品（中国药品生物制品检定所，批号：2009-7，规格：每支10 EU）；鲎试剂（TAL，厦门鲎试剂实验厂，批号：091149，标示灵敏度：0.5 EU·mL－1；批号：100101，标示灵敏度：0.25 EU·mL－1。湛江安度斯生物有限公司，批号：090325，标示灵敏度：0.5 EU·mL－1；批号：091124，标示灵敏度：0.25 EU·mL－1）。

2 方法与结果

2.1 细菌内毒素限值（L）的确定

细菌内毒素限值L＝K/（M·f），式中K为人每1 kg体重每1 h最大可接受的细菌内毒素剂量，注射剂为5 EU·kg－1·h－1；M为人用每1 kg体重每1 h的最大供试品剂量。按照马来酸桂哌齐特注射液说明书中用法用量，每次4支（320 mg），稀释于10%葡萄糖注射液或生理盐水500 mL中，静脉滴注，并明确规定滴注速度为100 mL·h－1（即滴注时间为5.0 h），则M＝320/（60×5.0）＝1.067 mg·kg－1·h－1（人平均体重按60 kg计）。f为安全系数，由于本品用于心脑血管类疾病，考虑到葡萄糖注射液或生理盐水也可能含有细菌内毒素，为了严格质量标准和计算方便，将安全系数f定为4.7[3]。因此，本品的细菌内毒素限值L＝5/（1.067×4.7）＝1.0 EU·mg－1。

2.2 样品最小有效稀释浓度（c）的确定

样品最小有效稀释浓度c＝λ/L，其中L为细菌内毒素限值，即1.0 EU·mg－1，λ为鲎试剂灵敏度。目前市售的鲎试剂的λ常为 0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 EU·mL－1，对应的样品最小有效稀释浓度为0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 mg·mL－1。

2.3 TAL灵敏度复核

按《中国药典》2010年版（二部）附录ⅪE“细菌内毒素检查法鲎试剂灵敏度复核项”[1]进行操作，其中阴性对照（NC）管操作方法：向分装有0.1 mL TAL溶液的试管内加入BET水0.1 mL，依法操作，结果见表1（表中“-”表示未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁脱落，即反应呈阴性；“+”表示管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不脱落，即反应呈阳性。以下各表同）。

表1 TAL灵敏度复核结果Tab 1 The checking results of tachypleus amebocyte lysate’s sensitivity

表1结果表明，4个批号的TAL灵敏度测定值λc均在0.5 λ～2.0 λ之间，符合规定，可用于试验。

2.4 干扰预试验[4～6]

用BET水将马来酸桂哌齐特注射液分别稀释至质量浓度为0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 mg·mL－1的系列溶液，测得pH值在6.8～7.2范围内，符合细菌内毒素检查的pH值要求，作为供试品阴性对照（NPC）系列。另制备同样浓度的供试品系列溶液，使每一浓度下的供试品溶液中都含有2 λ（λ为0.5 EU·mL－1）细菌内毒素，作为供试品阳性对照（PPC）系列。每一供试品浓度重复2管，按常规设立阳性对照（PC）管和阴性对照（NC）管。用2个不同厂家生产的鲎试剂（λ为0.5 EU·mL－1）与上述系列溶液进行反应，结果见表2。

表2 样品干扰预试验结果Tab 2 Results of interference pretest of samples

由表2可知，2个厂家的TAL所能得到的最大不干扰浓度是一致的，即质量浓度为0.5 mg·mL－1的供试品溶液对TAL与细菌内毒素之间的凝集反应有抑制作用，但当样品稀释至0.25 mg·mL－1及以下浓度时，抑制作用消失。

2.5 干扰试验

根据干扰预试验结果，用质量浓度为0.25 mg·mL－1的供试品溶液及BET水分别稀释细菌内毒素工作标准品，制备成细菌内毒素最终浓度分别为0.5、0.25、0.125、0.06 EU·mL－1的系列溶液，分别取0.1 mL加入到已复溶的2个不同厂家生产的TAL（λ为0.25 EU·mL－1）管内，每个浓度平行做4管，另取供试品溶液做2支NC管，进行干扰试验，结果见表3。

表3 样品干扰试验结果（0.25 mg·mL－1）Tab 3 Results of interference test of samples（0.25 mg·mL－1）

表3结果显示，Et/Es在0.5～2之间（Es为用BET水制成的细菌内毒素标准溶液反应终点浓度的几何平均值，Et为用供试品溶液制成的内毒素标准溶液反应终点浓度的几何平均值），按照《中国药典》2010年版（二部）判断标准，质量浓度为0.25 mg·mL－1的供试品溶液对TAL与细菌内毒素之间的凝集反应无干扰，细菌内毒素检查法适用于马来酸桂哌齐特注射液。

2.6 样品细菌内毒素检查

取3批马来酸桂哌齐特注射液（每批各取5支），制备成质量浓度为0.25 mg·mL－1的溶液，使用2个厂家生产的TAL（灵敏度λ均为0.25 EU·mL－1），按《中国药典》2010年版（二部）附录细菌内毒素检查法进行操作，并分别用BET水制备的细菌内毒素溶液（0.5 EU·mL－1）和BET水设立PC管和NC管，检查结果见表4。

表4 样品细菌内毒素检查结果Tab 4 Results of bacterial endotoxins test of samples

表4结果表明，3批样品的细菌内毒素检查均符合规定。

3 讨论

细菌内毒素检查法中要求供试溶液的pH值在6.0～8.0范围内，过酸、过碱的供试品需调节其pH值。因此，在试验中用pH计测定了质量浓度为0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 mg·mL－1的样品的pH值，结果均在6.8～7.2之间，不需调整，可直接用于细菌内毒素检查。

由表2干扰试验结果可以看出，将3批样品稀释至质量浓度为0.25 mg·mL－1，分别使用2个不同厂家生产的TAL（灵敏度均为0.25 EU·mL－1）进行干扰试验，其Et/Es均在0.5～2.0范围内，说明样品在该浓度下不干扰细菌内毒素检查。根据以上试验结果，确定马来酸桂哌齐特注射液的细菌内毒素检查方法如下：将本品稀释至质量浓度为0.25 mg·mL－1，依照《中国药典》2010年版（二部）附录细菌内毒素检查法进行检查，细菌内毒素限值定为1.0 EU·mg－1。

综上所述，建立的细菌内毒素检查方法可行，可用于马来酸桂哌齐特注射液的检查。

[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（二部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：附录99-102.

[2]中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范[S].北京：中国医药科技出版社，2005：287.

[3]黄清泉，夏振民.药品细菌内毒素检查的实验设计[J].中国药学杂志，1997，32（2）：72.

[4]潘卫松，肖 瑛，潘建明.荧光素钠注射液细菌内毒素检查法的研究 [J].中国药房，2009，20（13）：1010.

[5]刘 春，赵毓梅.马来酸氯苯那敏注射液的细菌内毒素检查[J].中国药房，2009，20（25）：1990.

[6]蔡 慎，郑英丽，陈宝玲，等.复方钾钙镁液中细菌内毒素检查法的可行性研究[J].中国药房，2010，21（21）：1997.