HPLC法测定维格列汀片中主药和有关物质的含量

李燕，赵春才，刘艳艳（1.南京医科大学附属南京儿童医院，南京市 10008；.南京安格医药化工有限公司，南京市 10009）

维格列汀[1]是Ⅳ型二肽基肽酶（DPP-4）抑制剂，通过与DPP-4结合形成DPP-4复合物而抑制该酶的活性，在提高胰高血糖素样多肽（GLP）-1浓度、促使胰岛B细胞产生胰岛素的同时，可降低胰高血糖素浓度，从而降低血糖，且对体重无明显影响。维格列汀片由诺华公司研发，2007年9月由欧盟委员会批准上市，商品名为Galvus。维格列汀片的含量及有关物质测定目前未见有文献报道，为此，本文建立了高效液相色谱（HPLC）法测定其主药和有关物质含量，为其质量评价和标准的建立提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

HPLC仪，包括LC-10ATvp泵、SPD-10Avp紫外检测器、UV-2401PC紫外-可见分光光度计（日本Shimadzu公司）。

1.2 试药

维格列汀片（南京安格医药化工有限公司制剂室，批号：100316、100317、100318，规格：每片50 mg）；维格列汀对照品（南京安格医药化工有限公司合成室，由批号为100302的原料药精制而成，含量：99.64%）；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Luna C18（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：0.01 mol·L－1磷酸氢二钾溶液-乙腈（75∶25）；流速：1.0 mL·min－1；检测波长：210 nm；进样量：20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品与对照品溶液：取样品片剂研成的粉末适量，约相当于维格列汀25 mg，精密称定，置于100 mL容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，过滤；取续滤液5.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另取维格列汀对照品，同法用流动相溶解并制成每1 mL中含125 μg的溶液作为对照品溶液。

2.2.2 有关物质溶液：取样品片剂研成的粉末（辅料不干扰测定）适量，用流动相制成维格列汀浓度为0.25 mg·mL－1的溶液作为供试液；取该液适量，用流动相稀释制成2.5 μg·mL－1的溶液作为对照液。

2.3 系统适用性试验

精密量取“2.2.1”项下对照品、供试品溶液各20 μL，按“2.1”项下色谱条件进样，并以空白辅料的流动相溶液作为阴性对照，进样分析。结果，在上述色谱条件下，维格列汀的理论板数为7293，保留时间为7.535 min，峰形对称，详见图1。

图1 高效液相色谱图A.阴性对照；B.对照品；C.供试品；1.维格列汀Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank excipients；B.reference substance；C.test sample；1.vildagliptin

2.4 线性关系与定量限考察

取维格列汀对照品，用流动相溶解并稀释成浓度分别为225.0、175.0、125.0、75.0、25.0 μg·mL－1的溶液，分别精密量取上述溶液各20 μL注入液相色谱仪，记录色谱。以进样浓度（c）为横坐标，维格列汀的峰面积（A）为纵坐标进行线性回归，得回归方程为A＝2.1654×104+3.5916×104c（r＝0.9999，n＝5）。表明维格列汀检测浓度的线性范围为25.0～225.0 μg·mL－1。以信噪比S/N＝10计算，得维格列汀定量限为8 ng。

2.5 精密度试验

取维格列汀对照品适量，按“2.2.1”项下方法制备对照品溶液，连续进样6次进行测定。结果，峰面积值的RSD＝0.21%。

2.6 重复性试验

精密称取同批样品6份，按“2.2.1”项下方法制备供试品和对照品溶液，各进样20 μL；在上述色谱条件下，分别测定每份样品的含量。结果平均含量为99.46%，RSD＝0.38%，表明本方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取供试品溶液1份，在0、1、2、4、6 h分别进样20 μL，测定，以峰面积计算RSD为0.19%，结果表明，供试品溶液在6 h内相对稳定。

2.8 回收率试验

取同批样品，按测试浓度的80%、100%、120%3个浓度分别加入维格列汀对照品，每个浓度3份，照“2.9”项下“（1）”项方法操作，计算回收率，结果详见表1。

2.9 样品含量测定

（1）主药含量：取维格列汀片研成的粉末及对照品适量，按“2.2.1”项下方法分别制备成供试品、对照品溶液。分别精密量取20 μL注入液相色谱仪，记录峰面积，并按外标法以峰面积计算含量，结果详见表2。

表1 回收率试验结果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

表2 样品中主药及有关物质含量测定结果Tab 2 Content determination of vildagliptin and the related substances in samples

（2）有关物质含量：取维格列汀片研成的粉末适量，按“2.2.2”项下方法制备成供试液和对照液。量取对照液20 μL注入液相色谱仪，调节仪器检测灵敏度，使维格列汀峰峰高为满量程的10%～30%；再量取供试液20 μL注入液相色谱仪，记录色谱至主峰保留时间的3倍，记录主峰和有关物质的峰面积，按1%自身对照法计算有关物质的含量，结果详见表2。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

取维格列汀对照品及片剂研成的粉末适量，分别用流动相制备成浓度约20 μg·mL－1的对照品、供试品溶液，按紫外分光光度法[2]操作，于190～400 nm波长范围内进行测定。结果，对照品、供试品溶液均于210、265 nm波长左右有最大吸收，但265 nm波长处响应值只有0.102，且前一步中间体在此波长下仅有末端吸收；而辅料溶液在210 nm波长处无吸收，故检测波长选为210 nm。

3.2 流动相的选择

通过对维格列汀及其各步中间体及破坏后样品的测定，发现采用浓度为0.01 mol·L－1的磷酸氢二钾溶液-乙腈（75∶25）为流动相时，维格列汀的峰形对称，与其有关物质、各步中间体和降解产物均能得到很好的分离，但由于有关物质含量较少，所以在色谱上不能明显表示，故未列出相应色谱图。通过对维格列汀原料药的分析，其纯度为99.08%，通过重结晶精制，纯度达到99.64%。

综上所述，本方法操作简便、快捷，结果准确、可靠，可有效测定维格列汀片中的主药和有关物质的含量，适用于控制该制剂质量。

[1]樊新星，徐 珽，卢 静，等.抗糖尿病新药维格列汀[J].中国新药杂志，2008，17（14）：1272.

[2]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（二部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：附录ⅣA.