RP-HPLC法测定穿心莲注射液中苯甲醇的含量Δ

叶静，毕开顺，宋肖炜，刘志红，陈晓辉（沈阳药科大学药学院，沈阳市 110016）

穿心莲注射液是由爵床科植物穿心莲Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees的干燥叶经乙醇加热回流提取制成的制剂，具有清热、解毒、凉血、消肿等功效[1]。其在生产过程中加入一定量的苯甲醇为抑菌剂。但是，近年来苯甲醇的毒副作用屡有报道:2%苯甲醇在试管内与兔和人的红细胞接触2 h即具有溶血作用，注射部位常发生青紫；它对中枢神经系统的毒性表现为头晕头痛、软弱疲乏、视力模糊、恶心呕吐、记忆力减退、步态不稳和手足发麻等症状；对新生儿而言，苯甲醇及其氧化所得中间产物更易进入脑内，导致中毒甚至死亡。因此，国家食品药品监督管理局于2005年即发文要求在所有含有苯甲醇的注射液说明书中必须标明“严禁儿童肌肉注射”的字样[2]。除此之外，过量肌肉注射苯甲醇后，由于注射区常有硬结，还可引起臀肌挛缩并发症，而臀大肌挛缩一经出现，非手术治疗是无效的。因此，苯甲醇含量测定是药品质控的重要内容。《中国药典》目前对注射剂中抑菌剂苯甲醇的用量尚无明确规定，而穿心莲注射液中苯甲醇的含量测定也未见有关文献报道。因此，为了降低不良反应的发生几率，有必要建立一种简便、准确的分析方法来控制穿心莲注射液中苯甲醇的含量。

1 仪器与试药

高效液相色谱（HPLC）仪，包括L-2130型液相色谱泵、L-2140型紫外检测器（日本HITACHI公司）。

穿心莲注射液（河南焦作市康华药业有限公司，批号:09113001、09113005、09113006）；苯甲醇标准品（天津博迪化工股份有限公司，分析纯，含量≥98.0%，批号:20100608）；乙腈（J&K SCIENTI FIC LTD.，色谱纯）；水为娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 标准品贮备液 取苯甲醇标准品适量，精密称定，置于100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得浓度为11.9 μg·mL-1的标准品贮备液。

2.1.2 供试品溶液 取本品适量，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.1.3 阴性对照溶液 取穿心莲叶，加20倍量90%乙醇热浸提取3次，每次4 h，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇至1∶1.5，加投料量5%～6%的活性炭加热回流30 min，趁热滤过，并用适量乙醇洗涤滤渣，合并滤液，加入3倍投料量的乙醇，搅拌均匀，静置24 h，滤过，滤液回收乙醇，制成流浸膏。按处方量1/10取流浸膏1 g，加入乙醇，置水浴上加热使溶解，再加入1.5 mL聚山梨酯80，搅匀，在搅拌下加入半量的注射用水，加入适量活性炭，充分搅匀，煮沸30 min，冷却至室温，冷藏过夜，滤过，加注射用水至100 mL，用8%～10%氢氧化钠溶液调节pH值至6，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得缺苯甲醇的阴性对照溶液。

2.2 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相:乙腈-水（35∶65）；流速:0.5 mL·min-1；检测波长:210 nm；柱温:40℃；进样量:20 μL。在上述色谱条件下，苯甲醇理论板数不低于4000，分离度与拖尾因子均符合含量测定要求。色谱见图1。

2.3 线性关系考察

精密量取苯甲醇标准品贮备液0.5、1、2、4、8、10 mL，分别置10 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，以0.45 μm微孔滤膜滤过，精密吸取续滤液20 μL注入液相色谱仪，按上述色谱条件进样测定，记录色谱图。以峰面积积分值（Y）对浓度（X，μg·mL-1）进行线性回归，得回归方程为Y＝161560X+9028.1（r＝0.9999，n＝6）。结果表明，苯甲醇检测浓度在0.595～11.900 μg·mL-1范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.4 检测限与定量下限测定

取苯甲醇标准品贮备液（11.9 μg·mL-1）适量，逐级稀释，按上述色谱条件进样测定。结果，色谱峰信噪比（S/N）＝3时的检测限为2.8 ng·mL-1，S/N＝10时的定量下限为5.6 ng·mL-1。

2.5 精密度试验

取同一标准品溶液适量，按上述色谱条件重复进样6次，记录色谱图。结果，苯甲醇峰面积的RSD＝0.3%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

取同一批（批号:09113001）穿心莲注射液适量，共6份，经0.45 μm微孔滤膜滤过，按上述色谱条件进样测定。结果，苯甲醇含量的平均值为3.13 μg·mL-1，RSD＝0.7%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取同一份供试品溶液适量，室温下放置，分别于0、1、2、4、8 h进样测定，记录色谱图。结果，苯甲醇峰面积的RSD＝1.4%（n＝5），表明供试品溶液在8 h内稳定。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的穿心莲注射液（批号:09113001，苯甲醇含量:3.13 μg·mL-1）5 mL，共9份，置10 mL 量瓶中，3份为一组，分别精密加入一定量的标准品贮备液（11.9 μg·mL-1），以水稀释定容，制成低、中、高3种浓度的供试品溶液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，按上述色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果见表1。

2.9 样品含量测定

分别取不同批号穿心莲注射液适量，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，采用外标法以峰面积计算苯甲醇的含量，结果见表2。

表1 加样回收率试验结果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

表2 穿心莲注射液中苯甲醇的含量测定结果（n＝5）Tab 2 Content determination of benzyl alcohol in Chuanxinlian injection（n＝5）

3 讨论

苯甲醇是注射剂中最常用的抑菌剂，连续肌肉注射可使局部产生硬结而影响药物的吸收。新生儿应用本品稀释和配制药物可引起中毒死亡，死亡原因是代射性酸中毒中枢神经系统抑制、低血压、血小板减少、肝肾衰竭和颅内出血等。美国FDA建议新生儿不应使用含苯甲醇的药物。此外，国外还有鞘内注射含苯甲醇注射液后引起无菌性脑膜炎的报道[3]。

苯甲醇在注射剂中的加入量一般为1%～2%[4]，因不同厂家生产工艺不同，注射剂中苯甲醇含量相差较大[5]，但迄今为止《中国药典》对其含量限度尚无明确规定。从本试验样品检测结果来看，该厂家生产的不同批号的穿心莲注射液中苯甲醇含量仅为微克级。

综上，本试验所建立的反相高效液相色谱法简便、准确、重复性好，可用于穿心莲注射液的质量控制。

[1]郑虎占，董泽宏，佘 靖.中药现代研究与应用[M].北京:学苑出版社，1998:349.

[2]陈 咏，林 红.HPLC法测定鱼肝油酸钠注射液中苯甲醇的含量[J].海峡药学，2009，21（11）:71.

[3]陈朝凤.药物制剂中附加剂的不良反应[J].科技资讯，2005，3（24）:174.

[4]谢秀琼.中药新制剂开发与应用[M].第3版.北京:人民卫生出版社，2006:146.

[5]葛海生，刘元瑞，赵康虎.HPLC法测定克林霉素磷酸酯注射液中抑菌剂苯甲醇的含量[J].中国药房，2010，21（25）:2376.