阿莫西林口服制剂微生物限度检查方法学验证研究

王艳，李晓平，刘珠，支丽娟，王淑娟（.河北省药品检验所，石家庄市 0500；.河北省儿童医院，石家庄市 0500；.长春工业大学，长春市 00）

阿莫西林为广谱抗菌药物，是目前应用较为广泛的口服青霉素之一。其制剂有胶囊、片剂、颗粒剂、分散片等。对该品种进行微生物限度检查时需要消除样品的抑菌性，才能真实地反映其微生物污染情况。而普遍使用的平皿法不能消除阿莫西林的抑菌性；薄膜过滤法操作过程复杂，有人为污染的危险，同时无法确定每次试验冲洗效果是否完全消除其抑菌性。因此十分有必要探索操作简便、结果可信度高、可应用敏感菌同步验证的微生物限度检查方法。

1 材料

1.1 试药

阿莫西林分散片（张家口圣大药业有限公司，批号:081106、081105、081107，规格:每片0.25 g）；阿莫西林颗粒（石药集团中诺药业有限公司，批号:080371，规格:每袋0.25 g；批号:081271，规格:每袋0.125 g；华北制药集团，批号:090303，规格:每袋0.125 g）；阿莫西林胶囊（石家庄科迪药业有限公司，批号:071005、070701、070901，规格:每粒0.5 g）。

pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、靛基质试液（河北省药品检验所制备）；营养肉汤培养基（批号:0104002）、改良马丁液体培养基（批号:001229）、改良马丁琼脂培养基（批号:011025）、营养琼脂培养基（批号:100105）、玫瑰红钠培养基（批号:010608）、胆盐乳糖培养基（批号:010607）、4-甲基伞形酮葡萄糖苷酸（MUG，批号:010912）均由北京三药科技开发有限公司提供；青霉素酶（张家口市格瑞生物化学科技有限公司，批号:20100402，规格:2400000 u·mL－1）。

1.2 对照菌

枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]（中国医学细菌保藏中心）。

2 方法与结果

2.1 菌液的制备

接种细菌计数方法对照菌，取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至5 mL营养肉汤培养基中35℃培养20 h；接种酵母菌计数方法验证用菌株，取白色念珠菌的新鲜培养物至5 mL改良马丁液体培养基中，25℃培养20 h；接种霉菌计数方法验证菌株，取黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中，25℃培养7 d，加4 mL 0.9%无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子。取上述1 mL各菌培养物或孢子液加0.9%无菌氯化钠溶液9 mL，采用10倍递增稀释法，制备各菌液（菌落数在10～100 cfu·mL－1）。

2.2 试验方法

试验组:取供试液1 mL，注入平皿中，加入“2.1”项下菌液1 mL，每株试验菌平行制备2个平皿；菌液组:取5株试验菌液各1 mL，分别注入平皿中，每株试验菌平行制备2个平皿；供试品对照组:取供试液1 mL，分别注入平皿中，每种供试液平行制备2个平皿；稀释剂对照组:取稀释液1 mL，分别加入各菌悬液1 mL。上述各组，细菌计数检查项注入营养琼脂培养基，霉菌及酵母菌计数检查项注入玫瑰红钠培养基。按规定条件培养后，计算各试验菌的回收率:试验组的菌回收率＝（试验组的平均菌落数－供试品对照组的平均菌落数）/菌液组的平均菌落数×100%；稀释剂对照组的菌回收率＝稀释剂对照组的平均菌落数/菌液组的平均菌落数×100%。

2.3 供试液的制备及试验结果

2.3.1 未加酶供试液。分别称取9批供试品各10 g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，45℃保温振摇，使溶散；静置取上清液作为1∶10供试液A，进行平皿法验证试验，结果见表1。

由表1可见，该方法白色念珠菌和黑曲霉的回收率大于70%，因此采用该法可以进行样品的霉菌及酵母菌计数检查；但金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和枯草芽孢杆菌的回收率均为0%，因此需要探索细菌计数方法并验证。

表1 供试液A验证试验结果（回收率，%）Tab 1 Result of validation test of test sample A（recovery rate，%）

2.3.2 加酶供试液。分别称取9批供试品各10 g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至98 mL，45℃保温振摇，使溶散后至离心管中，500 r·min－1离心沉淀3 min；取上清液49 mL加青霉素酶1 mL摇匀，静置30 min，作为1∶10供试液B，进行平皿法验证试验，结果见表2。

表2 供试液B验证试验结果（回收率，%）Tab 2 Result of validation test of test sample B（recovery rate，%）

表2结果表明，阿莫西林颗粒和胶囊在该条件下，5株试验菌的回收率均达到70%以上，该方法已经消除了样品的抑菌性，可以进行样品的细菌检查。分散片遇水能迅速崩解形成均匀的黏性混悬液，低速离心不能使不溶性阿莫西林沉降，故其上清液中阿莫西林量较其他2种剂型中的量增加。该试验条件不能使分散片中阿莫西林充分灭活，因此需要进一步加大青霉素酶的用量，重新验证大肠埃希菌的回收率。

2.3.3 加大酶量供试液。取3批分散片供试品各10 g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至96 mL，45℃保温振摇，使溶散后至离心管中，500 r·min－1离心沉淀3 min，取上清液48 mL加青霉素酶2 mL摇匀，静置30 min，作为1∶10供试液C，进行验证试验，结果3批样品（081105、081106、081107）大肠埃希菌回收率分别为91.7%、89.6%、96.5%。

阿莫西林分散片的供试液B对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌没有抑菌性，而对大肠埃希菌有抑菌性；加大青霉素酶量酶后制备的供试液C，阿莫西林灭活完全，消除了对大肠埃希菌的抑菌性。该结果表明阿莫西林微量存在时，大肠埃希菌较为敏感，因此，大肠埃希菌可以作为该药品的敏感菌。

2.3.4 稀释剂。取1 mL青霉素酶加49 mL pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液混匀，作为青霉素酶法的稀释剂对照组D，进行稀释剂验证试验，结果见表3。

由表3可见，该稀释剂各试验菌回收率均大于70%，说明稀释剂对试验结果没有影响。

2.3.5 控制菌大肠埃希菌检查方法验证。取100 mL胆盐乳糖培养基4份，第1份加入10 mL供试液B，第2份加入10 mL供试液B和大肠埃希菌的菌悬液1 mL，第3份加入大肠埃希菌的菌液1 mL、第4份加稀释剂10 mL。35℃培养18～24 h后，各取0.2 mL，分别加至5 mL MUG中，35℃培养5、24 h，将各管置于365 nm紫外灯下观察有无蓝白色荧光，然后加靛基质试液4～5滴于上述MUG管内，观察液面颜色。有荧光（MUG）及呈玫瑰红色（indole）说明检出大肠埃希菌，记为“+”；无荧光及无色说明未检出大肠埃希菌，记为“-”，结果见表4。

表3 稀释剂D验证试验结果（回收率，%）Tab 3 Result of validation test of thinners D（recovery rate，%）

表4 大肠埃希菌检查方法验证结果Tab 4 Validation result of the method of Escherichia coli

由表4可见，供试液B第2份试验组结果表明检出大肠埃希菌，说明该方法可以作为控制菌大肠埃希菌的检查方法。

2.3.6 样品检查。取9批供试品，霉菌及酵母菌计数采用平皿法检查。其细菌计数检查分为2种:胶囊和颗粒按供试液B制备方法采用平皿法检查，分散片按供试液C制备方法采用平皿法检查，结果见表5。

表5 样品检查结果（菌落计数，cfu·g－1）Tab 5 Results of sample test（counts，cfu·g－1）

3 讨论

依据阿莫西林在水中微溶[1]的特性，取10 g供试品加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，溶散后低速离心制备的上清液，大部分主药均在沉淀物中。假设上清液中不含不溶性阿莫西林，理论上其中阿莫西林可能的最大含量为1 g·100 mL－1。因此，上清液中的阿莫西林含量几乎不受样品规格中主药含量的影响，而辅料则是影响上清液中阿莫西林含量的主要因素。

由于上清液中含阿莫西林可能的量为1 g·100 mL－1（1 mg阿莫西林相当于1400 u青霉素），即100 mL的上清液中含1400000 u的青霉素。理论上加2～4倍单位的青霉素酶可使青霉素灭活[2]。供试液C中，50 mL的上清液约含相当于700000 u的青霉素，因此，用2400000 u的青霉素酶1 mL可以使其灭活。

供试液加入青霉素酶后，应使二者充分混匀，并静置约30 min使β-内酰胺完全灭活，观察现象可见溶液由浑浊变为澄清。

阿莫西林分散片在生产过程中，将原料药进行微粉化处理，选用了良好的崩解剂，在水中形成均一的混悬液，因此供试液离心沉淀后上清液中阿莫西林量增加，故青霉素酶的用量需要加倍，才可消除对试验菌的抑菌性。依据该试验结果，应考虑辅料对不同剂型供试品的上清液中阿莫西林含量的影响，对青霉素酶用量进行验证。

阿莫西林口服制剂有胶囊、片剂、颗粒剂、分散片。分散片是在片剂的基础上，添加了以增强其黏性为目的的工序。而片剂供试液的黏性低于分散片，上清液中阿莫西林量不高于分散片。因此本试验中分散片的研究结果可代替普通片剂，故不再选取普通片剂进行试验。本研究结果对阿莫西林口服制剂的微生物限度检查有普遍意义。

对完全灭活的供试液采用平皿法进行细菌计数检查，即可有效检出供试品中污染的微生物。该方法较薄膜过滤法简便易行，操作环节少，并可减少操作过程中的污染机会。

大肠埃希菌为该样品的敏感菌，每批样品检查时应进行大肠埃希菌的回收率试验。回收率大于70%，证明细菌检查结果无误，检验结果准确；如果回收率小于70%，表明没有完全消除供试品的抑菌性，需重新检查。该方法可保证每批次供试品的试验结果可信。

阿莫西林对白色念珠菌和黑曲霉无抑菌作用，因此对于霉菌及酵母菌检查可以采用平皿法检查。

[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（二部）[S].2010年版.北京:中国医药科技出版社，2010:401.

[2]苏德模，马绪荣.药品微生物学检查技术[M].北京:华龄出版社，2007:265.