姜黄素固体脂质纳米粒单用或与顺铂联用对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用研究

邓舒婷，甘霖，周琦，#，徐建业，李少林（.重庆市肿瘤研究所妇瘤科，重庆市40000；.重庆医科大学放射医学教研室，重庆市 40006；.重庆市肿瘤研究所临床检验中心，重庆市 40000）

卵巢癌是女性生殖器官常见的肿瘤之一，病死率居妇科恶性肿瘤首位，对妇女生命造成严重威胁。以顺铂（Cisplatin，DDP）为基础的联合化疗，能有效提高患者生存率。但因顺铂等化疗毒副作用大，且长期使用会产生耐药性，可能导致肿瘤进展或复发。故寻找能增强疗效并减轻化疗毒副作用的药物或化疗组合，日益成为研究热点。姜黄素（Curcumin，Cur）是从中药姜黄中提炼出的有效成分。有研究[1～3]证实，Cur对体外培养的多种肿瘤细胞系均有生长抑制作用。固体脂质纳米粒（Solid lipid nanoparticles，SLN）是近年来正在发展的新型纳米载药体系，可延长药物在血液中的半衰期，有效提高药物的生物利用度。目前，国内、外尚未见关于姜黄素固体脂质纳米粒（Curcumin-loaded solid lipid nanoparticles，Cur-SLN）抗妇科肿瘤的研究报道。本试验采用溶液扩散法制备Cur-SLN，并研究其单用或与DDP联用对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用，为今后Cur-SLN治疗卵巢癌的化疗临床应用提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

ELX800酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）；倒置显微镜（日本Olympus公司）；透射电镜（日本日立公司）；流式细胞仪（上海邦逞医疗器械有限公司）。

1.2 试药

小牛血清（兰州民海生物工程有限公司，批号:20091015）；Cur（美国Sigma公司，批号:100K3447，规格:每瓶250 mg，纯度:99%）；DDP冻干灭菌粉末（山东罗欣药业股份有限公司，批号:09061001-2，规格:每瓶10 mg）；青霉素、链霉素冻干灭菌粉末（华北制药集团有限责任公司，批号:B0501013、B050310，规格均为每瓶800 万u）；Cur-SLN（重庆市肿瘤研究所临床检验中心分子生物学实验室自制，包封率:85.3%，载药量:73.2%）；其余试剂均为分析纯。

1.3 细胞

人卵巢癌SKOV3细胞株（来源于重庆医科大学肿瘤学教研室）。

2 方法

2.1 Cur-SLN混悬液的制备

采用溶液扩散法，根据前期单因素考察及参考文献[4]，确定较优制备工艺。精密称取Cur 8 mg（27 μmol）和硬脂酸80 mg溶于无水乙醇3 mL中，加热至50℃，滴入聚乙烯醇溶液中，搅拌2 h。将所得混悬液3000 r·min－1离心3 min，蒸馏水清洗2次，再加入适量蒸馏水，超声10 min，即得浓度为20 μmol·L－1的Cur-SLN混悬液，置于4 ℃保存备用。

2.2 细胞培养

将SKOV3细胞培养在RPIM-1640培养液中（含10%小牛血清、100 u·mL－1青霉素及链霉素），置于37 ℃、5%CO2孵箱中备用。

2.3 细胞生长抑制率的检测

采用MTT法，取SKOV3细胞常规消化并制成浓度为5×105个/mL悬液，接种于96孔板，每孔200 μL，加入不同浓度药物，每个药物浓度设4个复孔。分别培养24、48、72 h后，加入浓度为5 mg·mL－1的MTT 20 μL继续培养，4 h后离心去上清，加二甲基亚砜（DMSO）200 μL，充分吹打震荡10 min，于酶标仪上540 nm波长下测定吸光度（A）值，试验重复3次取平均值。按下式计算细胞生长抑制率（%）＝（1－实验药物组A/空白对照组A）×100%。

单用试验，分组为空白对照组、Cur组及Cur-SLN组。其中空白对照组加入培养液20 μL；Cur组分别加入10、20、40、60、80 μmol·L－1的Cur（用蒸馏水稀释）20 μL；Cur-SLN组分别加入10、20、40、60、80 μmol·L－1（以Cur计）的Cur-SLN 20 μL。

联用试验，分组为空白对照组、DDP组、DDP+Cur组及DDP+Cur-SLN组。其中空白对照组加入培养液20 μL；后3组中DDP终浓度均为1、2、3、4、5 μmol·L－1，加入量均为20 μL，Cur终浓度均为10 μmol·L－1（Cur-SLN浓度经预试验得出，约为半数抑制浓度（IC50）的1/3，为方便比较，Cur终浓度同Cur-SLN），加入量为20 μL。

2.4 细胞凋亡率与细胞周期分布的检测

取细胞悬液20 mL，其中细胞数为1×106个，接种于200 mL培养瓶内培养24 h，分组为空白对照组、DDP组、Cur组、Cur-SLN组、DDP+Cur组及DDP+Cur-SLN组（DDP终浓度均为2.5 μmol·L－1，Cur终浓度均为10 μmol·L－1），加入量均为20 μL，培养24 h，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗2次，转至1.5 mL离心管中，3000 r·min－1离心3 min，加1 mL含2%小牛血清的PBS液混匀；用预冷75%乙醇固定，吹打成单细胞悬液，4℃放置30 min，1000 r·min－1离心20 min；加PBS液后再离心，去固定液，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期分布，用Modifit 1.0软件分析结果。

2.5 细胞周期调控因子Cyclin E、CDK2表达的检测

细胞浓度及用量、分组同“2.4”项，接种于200 mL培养瓶内，加PBS液清洗3次，投入冷丙酮（4℃）中，在各组培养瓶内放置无菌盖玻片培养24 h。待细胞生长至近融合状态时，取出盖玻片，用PBS液清洗3次，细胞面向上投入4℃冷丙酮中固定5 min，用PBS液（pH7.4）冲洗3次，每次1 min，之后以二氨基联苯胺显色法（DAB法）进行细胞周期调控因子Cyclin E、CDK2免疫组化染色，最后自来水充分冲洗，复染封片，显微镜下观察、鉴定，半定量分析，测定细胞周期标记指数（LI）。

2.6 统计学方法

所有资料应用SPSS13.0软件进行统计学分析，数据采用表示，MTT试验数据分析采用2×2×2析因设计的方差分析，流式技术和DAB数据分析采用2×2析因设计的方差分析，两两比较采用S-N-K法，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 细胞生长抑制率检测结果

3.1.1 单用试验结果。随着各组药物浓度的增加及作用时间延长，细胞生长抑制率呈上升趋势，并在一定范围内呈浓度、时间依赖性，且在同一浓度及作用时间下，Cur-SLN组较Cur组对SKOV3细胞的生长抑制作用更显著（P＜0.05）。单用试验各组对SKOV3细胞作用不同时间后细胞生长抑制率比较见图1。

图1 单用试验各组对SKOV3细胞作用不同时间后细胞生长抑制率比较Fig 1 Comparison of inhibition rate of SKOV3 cell growth in single drug group after different treatment time

3.1.2 联用试验结果。（1）DDP对SKOV3细胞生长的作用。随着浓度增加及作用时间延长，DDP对SKOV3细胞的生长抑制率均升高，呈浓度、时间依赖性。（2）DDP+Cur及DDP+Cur-SLN对SKOV3细胞生长的作用。与DDP组比较，DDP+Cur组及DDP+Cur-SLN组对SKOV3细胞的生长抑制率随DDP浓度增加和作用时间延长均升高，其中DDP+Cur-SLN组较DDP组和DDP+Cur组升高有明显差异（P＜0.05），呈浓度、时间依赖性。表明Cur-SLN与DDP联用有明显协同作用，可提高肿瘤对DDP的敏感性。联用试验各组对SKOV3细胞作用不同时间后细胞生长抑制率比较见图2。

图2 联用试验各组对SKOV3细胞作用不同时间后细胞生长抑制率比较Fig 2 Comparison of inhibition rate of SKOV3 cell growth in drug combination group after different treatment time

3.2 细胞凋亡率与细胞周期分布比较

与空白对照组比较，各组均出现S期细胞比例逐渐降低、G2期细胞比例逐渐增加的现象；Cur-SLN组较Cur组发生G2期阻滞、诱导细胞凋亡的作用更显著；当DDP与Cur-SLN联用时细胞凋亡率为17.94%，较DDP组（4.65%）及Cur-SLN组（7.69%）均明显升高（P＜0.05）。细胞凋亡试验各组对SKOV3细胞周期及凋亡率影响见表1。

表1 细胞凋亡试验各组对SKOV3细胞周期及凋亡率影响Tab 1 Effect of cell apoptosis test on cell cycle and apoptosis rate of SKOV3 cells

3.3 Cyclin E、CDK2表达结果比较

空白对照组Cyclin E、CDK2阳性表达的LI值分别为（17±3.12）%、（20±4.41）%，而 DDP 组为（26±4.18）%、（32±5.61）%，Cur组为（21±4.03）%、（23±4.73）%，Cur-SLN组为（27±5.36）%、（34±3.82）%，DDP+Cur组为（23±5.15）%、（31±4.76）%，DDP+Cur-SLN 组为（35±5.93）%、（38±6.16）%，其中DDP+Cur-SLN组较其他组阳性表达明显增强（P＜0.05）。与空白对照组比较，各组表达均有显著性差异（P＜0.05）。

4 讨论

植物来源的抗肿瘤药近年来在新药开发上显示出了巨大潜力，成为新型抗肿瘤药物的重要来源，如Cur、紫杉醇、喜树碱、莪术醇[5]等。Cur提取自中药姜黄，其主要药理作用包括抗肿瘤、抗炎、降血脂等，且毒性作用较少，对正常组织细胞几乎不产生不良影响[6]。近年来Cur的抗肿瘤作用成为研究热点，机体内部实验证实Cur可有效抑制肿瘤侵袭以及转移，体外试验证实Cur具有抑制肿瘤细胞增殖、促进细胞凋亡等作用[7]。Cur的抗癌谱广且毒副作用小，美国国立癌症研究院已将其列为第3代抗癌化学预防药。但因Cur不溶于水，耐光性、耐热性较差，体外易被氧化，限制了其作为抗癌新药的研制及临床应用。

SLN是一种粒径在10～1000 nm之间的新型胶体给药系统。药物可包埋或溶解在纳米粒的内部，也可吸附或偶合在其表面，具有较好的生物相容性。目前SLN有多种制备方法，如高压乳匀法、乳化蒸发-低温固化法、薄膜超声法、微乳法等[8]。本文采用溶液扩散法制备方法简单，所制纳米粒粒径足够小，既适于实验室研制，也比较容易规模化生产。

本研究发现，Cur-SLN是通过诱导人卵巢癌SKOV3细胞凋亡、阻滞细胞周期而发挥抑制细胞增殖及促凋亡作用的。这也正是DDP等化疗药物抑制肿瘤细胞增殖的重要机制。研究结果显示，Cur-SLN单用或与DDP联用于SKOV3细胞均可起到诱导细胞凋亡的作用，且2药联用时细胞凋亡率显著增加。Cur-SLN及DDP均可使SKOV3细胞发生G2期阻滞，抑制肿瘤细胞生长，2药联用细胞生长抑制作用更显著，提示Cur-SLN可以增强DDP对肿瘤细胞诱导凋亡的作用。同时，加入Cur-SLN后的各组Cyclin E、CDK2表达较Cur组均有所升高，尤其是DDP+Cur-SLN组升高最明显。

综上所述，Cur-SLN对人卵巢癌SKOV3细胞有明显的生长抑制及促凋亡作用，且与DDP联用有协同效果。本试验为Cur抗肿瘤药的进一步开发应用、减少DDP临床用量、降低肾毒性并提高化疗效果提供新思路及试验依据。

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[5]林 海，李晓辉.莪术醇诱导白血病L1210细胞凋亡作用研究[J].中国药房，2008，19（30）:2328.

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