奶牛乳房炎乳中结合珠蛋白含量的夹心ELISA检测方法研究

杨 宇，吕 英，石 晶，李庆章

(东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030)

乳房炎对奶牛的健康和产奶量有一定的影响，因此建立一种简单、准确、快速、有效的乳房炎诊断方法是十分必要的。奶牛乳房炎与细菌感染密切相关，奶牛受感染乳区在炎症期间能够产生急性期蛋白[1-3]。结合珠蛋白(Haptoglobin，Hp)是一种奶牛乳房炎期间重要的急性期蛋白，其血液和乳汁中含量变化与乳房炎患病情况密切相关。Hp作为新发现的乳房炎诊断敏感性指标，在乳房炎的诊断中具有一定的应用价值和应用前景[4-6]。目前对乳房炎的诊断一般采用物理和化学的方法，乳房炎期间乳清中Hp含量检测方法国内尚未报道。

Hp是一种能够和血红蛋白(Hemoglobin，Hb)特异性结合形成稳定化合物的糖基化蛋白[7]。研究表明，牛奶中Hp仅来源于肝细胞Hp产物，但是近期研究表明，Hp mRNA也可以在乳腺中翻译，并且Hp可在乳腺中表达[8]。因此可以利用检测牛奶中Hp含量确定奶牛患乳房炎的情况。本研究基于商品化抗体，利用血红蛋白与结合珠蛋白特异性结合的原理，建立夹心ELISA检测Hp含量方法，从而为Hp夹心ELISA检测试剂盒的提供试验方法。

1 材料和方法

1.1 样品采集及制备 选取黑龙江省哈尔滨市周边奶牛场处于相同生理水平(年龄、泌乳期和产奶量)的荷斯坦奶牛，无菌采集牛奶样品，每头奶牛采集牛奶样品100 mL，50 mL用于体细胞数，50 mL保存于4℃，12000 r/min离心30 min，乳清-20℃保存备用。

所有牛奶样品应用体细胞计数法(SCC)计数。按照文献[9-11]的判定标准判定样品：SCC<200×103cells/mL样本定为健康样本；200×103cells/mL1000×103cells/mL为乳房炎临床样本。

1.2 主要试剂及试剂盒 牛血清白蛋白(BSA)和4-硝基苯基磷酸二钠盐(pNPP)均购自Sigma公司；Hp标准品和牛Hp-ELISA检测试剂盒(酶标板，牛Hp标准品，HRP标记抗Hp抗体，底物显色液，终止液)均购自美国R&D公司；山羊抗牛Hp多抗购自Innovative公司；碱性磷酸酶(AP)标记兔抗山羊酶标抗体购自北京中杉生物公司；FOSSMATIC 5000系列体细胞快速测定仪为丹麦福斯公司产品。

1.3 ELISA操作程序 用0.01 mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.5)稀释牛Hb包被酶标板，4℃过夜，37℃1 h，加入Hp标准品溶液和待检乳清(100 μL/孔)，37℃1 h，加入山羊抗牛 Hp多抗(100 μL/孔)，37℃1 h，加入AP标兔抗山羊酶标抗体(100 μL/孔)，37℃1 h，加入底物溶液(100 μL/孔)，室温避光30 min，NaOH(100 μL/孔)终止反应；使用酶标仪测定OD405nm值。在OD405nm值接近1.0时，P/N值>2.1并呈现最大的反应条件为确定ELISA反应条件的参考依据。

1.4 ELISA反应条件的确定

1.4.1 牛Hb包被条件的确定 牛Hb结合Hp四聚体的能力为1∶1.1和1∶1.4[12]，因此本实验分别以10%、20%和50%的牛Hb包被酶标板，分别于37℃1 h、37℃2 h和4℃孵育过夜。

1.4.2 封闭液和封闭时间的确定 分别以1%、2%和3%BSA作为封闭液，37℃分别作用1、2和3 h，测定其OD405nm值，选择最佳封闭液和封闭时间。

1.4.3 多抗和乳清工作浓度及作用时间的确定 以10%Hb包被酶标板，4℃过夜。进行ELISA检测，加入经稀释的多抗(1∶600～1∶4800)和乳清(1∶5～1∶50)。选择OD405nm值接近1.0，并且抗体与阳性、阴性乳清P/N最大的多抗工作浓度和乳清稀释度。

1.4.4 酶标抗体工作浓度及作用时间的确定 选择1∶200～1∶800 稀释度，37 ℃孵育 0.5 h～2 h，选择OD405nm值接近1.0，并且抗体与阳性、阴性乳清P/N最大的酶标抗体最适稀释度和作用时间。

1.4.5 底物显色时间和终止液浓度的确定 加底物后5 min～15 min，分别用1 mol/L～3 mol/L NaOH终止反应选择最适底物显色时间和终止液浓度。

1.5 ELISA检测下限(LOD)的确定 根据优化的条件，进行ELISA反应，以系列稀释度2.5 g/mL～0.08 μg/mL的Hp标准液建立标准曲线。以Hp浓度为横坐标，OD405nm值为纵坐标，绘制标准曲线，建立回归方程。LOD为在标准曲线上对应的Hp浓度值。

1.6 ELISA检测灵敏度的测定 从标准曲线的LOD继续倍比稀释测定OD值，确定本实验ELISA检测灵敏度。

1.7 精确度的测定 以批内和批间差表示该方法的精确度。将每一标准品浓度重复检测4次，计算孔间变异系数表示批内差；使用同质量的不同酶标反应板重复操作3次，计算批间变异系数表示批间差。

1.8 交叉反应试验 应用本实验建立的ELISA方法对乳房炎期间的主要急性期蛋白：Hp、MPO和牛IgG标准品进行交叉反应试验，以确定ELISA检测的特异性。

1.9 酶标包被板稳定性测定 将按最佳浓度包被好的酶标板置于4℃下0～6个月，按ELISA过程操作检测其OD405nm值。

1.10 奶牛乳清样本的测定 选取50份SCC法检测患有乳房炎疾病奶牛的乳清样品，分别应用本方法与牛Hp-ELISA检测试剂盒检测样品中Hp含量。

1.11 数据分析 使用SPSS 17.0软件分析本方法和牛Hp-ELISA检测试剂盒的检测数据，比较两者的相关性。

2 结果

2.1 SCC测定乳房炎 使用丹麦福斯公司FOSSMATIC 5000系列体细胞快速测定仪测定290个样品，根据SCC将检测样本分为3组，各组检出样本数量中，健康样品居多(表1)。

表1 SCC分组及患病情况Table 1 The groups by SCC and the states of disease

2.2 ELISA反应条件的确定 对ELISA各项条件进行优化，确定最佳反应条件为：10%Hb包被酶标板，4℃过夜；BSA工作浓度为2%，37℃1 h；最佳样本稀释度为乳清1∶10稀释，多抗工作浓度为1∶1000；最佳酶标抗体工作浓度为1∶500，37℃1 h，最佳显色时间为15 min，2 mol/L NaOH终止反应。

2.3 ELISA LOD的确定 根据试验数据绘制标准曲线，得到回归方程为y=0.1526x+0.2037，R2=0.97。检测下限 LOD=0.08 μg/mL，线性范围为0.08 μg/mL～2.50 μg/mL(图 1)。

图1 Hp标准曲线Fig.1 Hp standard curve

2.4 ELISA检测灵敏度的测定 本研究建立的夹心ELISA法的灵敏度结果表明，当Hp抗原稀释至0.08 μg/mL时 P/N>2.1，而当 Hp抗原稀释至0.04 μg/mL时P/N<2.1，因此该方法对Hp的检测灵敏度为 0.08 μg/mL(表 2)。

表2 灵敏度试验结果Table 2 Results of sensitivity experiment(±SD,n=5)

表2 灵敏度试验结果Table 2 Results of sensitivity experiment(±SD,n=5)

Hp浓度(μg/mL)0.080.040.020.010 Hp concentration(μg/mL)OD405nm均值±标准差0.391±0.0180.160±0.0150.137±0.0130.116±0.0150.089±0.016

2.5 精确度的确定 由Hp标准品建立的标准曲线批内、批间误差试验结果表明，在线性范围内标准品浓度的批内变异系数为3.27%～4.98%，批间变异系数为5.46%～8.31%(表3)。

表3 夹心ELISA批内误差和批间误差试验Table 3 Intro-assay and Inter-assay test of the sandwich ELISA

2.6 交叉反应试验 应用本实验建立的ELISA方法对乳房炎期间的主要急性期蛋白：Hp、MPO和牛IgG标准品进行交叉反应试验。除Hp呈阳性外，其余均呈阴性，表明本实验具有良好的特异性。

2.7 酶标包被板稳定性测定 稳定性试验表明，包被酶标板在4℃下可保存6个月，测定OD405nm值变化较小，说明包被板具有良好的检测稳定性(表4)。

表4 Hb包被酶标板稳定性试验结果Table 4 The resuls of stability of plate coated with Hb(±SD,n=5)

表4 Hb包被酶标板稳定性试验结果Table 4 The resuls of stability of plate coated with Hb(±SD,n=5)

月数01246 Months OD405nm均值±标准差0.891±0.0140.887±0.0140.880±0.0160.879±0.0170.881±0.018

2.8 奶牛乳清样本的测定 选取50份根据SCC分组的乳清样本，分别应用本实验建立的夹心ELISA法和牛Hp-ELISA检测试剂盒检测乳清中Hp含量，结果表明，两种方法检测牛奶中Hp含量均与牛奶SCC成正比(表5)，证实牛奶中Hp含量与乳房炎的患病情况呈正相关。

2.9 数据分析 使用SPSS 17.0数据统计分析软件对2.7测定样本数据进行分析，以ELISA检测结果为纵坐标，以ELISA试剂盒检测结果为横坐标做线性回归分析。回归方程为：y=1.0293x+0.0886(R2=0.9962)(图2)。表明本实验建立的ELSIA法检测Hp含量结果与牛Hp-ELISA检测试剂盒检测结果具有良好的相关性，表明ELSIA方法的可靠性。

表5 商品化试剂盒与ELISA比较试验Table 5 Comparison between the commercial kit and ELISA

图2 ELISA法与商品化试剂盒检测乳清中Hp浓度相关性Fig.2 Correlations of concentrations of Hp in whey samples by ELISA and the commercial kit

3 讨论

本研究应用Hp和Hb特异性结合原理，建立夹心ELISA检测奶牛乳中Hp含量方法。对建立的方法进行优化，使用夹心ELISA方法和牛Hp-ELISA检测试剂盒检测50份牛奶样品中的Hp含量，结果表明，夹心ELISA方法检测结果具有较好的敏感性和特异性，操作简便，可重复性强，便于保存，适用于奶牛乳房炎乳中Hp含量的检测及乳中Hp含量的评价。

Hp作为一种敏感的急性期反应蛋白，一般在肝脏内合成，其表达受不同因素的调节，如细胞因子和前列腺素(PG)等；一些病理状态也会影响血液中Hp含量的变化，如炎症、创伤和感染等[13]。Khoshvaghti等对患有外科感染、急性子宫炎、急性局部外伤性网状腹膜炎(TRP)与健康奶牛的血清和牛奶中Hp含量进行比较测定，血清中Hp浓度显著升高，虽然牛奶中Hp浓度也有升高，但含量却很低(最高为0.41 μg/mL)[14]。这些病理状态下血液中Hp可能会通过血乳屏障进入乳中，但乳中Hp含量极少并且变化不显著。有研究表明，轻度乳房炎奶牛的血清和牛奶中Hp含量均迅速升高[3]，与本研究的结果相同，在乳房炎期间乳中Hp浓度由0.67 μg/mL迅速升高至1.52 μg/mL。研究表明奶牛乳房炎期间牛奶中Hp的合成与释放与中性粒细胞相关，并表明中性粒细胞和乳腺上皮细胞是乳中Hp肝外合成的主要来源[15]。由于奶牛在患乳房炎期间，乳房是其主要的患病器官，牛奶中Hp含量相对其他病理时期较高，并且变化显著。因此在奶牛患有乳房炎期间可以检测到牛奶中Hp含量，并可以作为诊断乳房炎的一种方法。

检测乳房炎的方法中，以SCC检测最为准确，但敏感性和特异性不高，并且不易推广。本研究建立的ELISA方法较SCC法、双抗夹心ELISA方法具有良好的灵敏性和特异性，具有操作简单、特异性强、经济适用等特点，非常适用于奶牛乳清Hp含量检测，并可对奶牛乳房炎乳中Hp含量做准确评价为乳房炎进行实时监控、实地预防和及时治疗提供试验方法。

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