马立克氏病病毒感染鸡羽髓上皮细胞差异蛋白质组学研究

丛 锋，刘长军，张艳萍，李志杰，张 锋，成 云，杨文闯，许娜娜

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室，黑龙江 哈尔滨 150001)

马立克氏病病毒(Marek's disease virus，MDV)为鸡和火鸡的一种高致瘤性疱疹病毒，能够在鸡羽髓处形成感染性病毒粒子并释放至环境中。因此，羽髓上皮细胞对于MDV的增殖和传播具有重要意义[1]。研究表明，MDV感染后7 d即可在羽髓中检出病毒，21 d病毒载量达到峰值，之后下降[2]。另外有研究显示，MDV感染后4 d即引起羽髓中CD4+和CD8+T淋巴细胞浸润，10 d达到峰值；同时，IL-18、IL-6和IFN-γ等细胞因子在mRNA水平的表达量显著升高[3-4]。但是目前这些研究均为DNA或mRNA水平进行的个别基因或蛋白质的检测。蛋白质组学技术可以大规模鉴定蛋白质，更真实地反映蛋白质的表达情况、翻译后的修饰以及蛋白质与蛋白质之间的相互作用。因此，本实验应用蛋白质组学方法对MDV感染的鸡羽髓上皮细胞进行研究，筛选并鉴定差异表达蛋白，为进一步研究羽髓中MDV的复制、基因的表达以及宿主的应答等奠定基础。

1 材料和方法

1.1 病毒株和实验动物 MDV强毒GA株购自美国标准菌种收藏所(ATCC)，由本实验室继代培养至第5代；1日龄SPF白色来航鸡由哈尔滨兽医研究所SPF实验动物中心提供。

1.2 主要试剂和仪器 蛋白定量试剂盒、尿素、硫脲、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺、去垢剂CHAPS、IPG干胶条和IPG缓冲液(pH3～pH10)均购自美国安玛西亚公司；等电聚焦系统(Ettan IPGphorⅢ)、胶条槽(Ettan IPGphor Manifold)、标准垂直电泳系统(SE 600 Ruby)和扫描仪(ImageScanner)均为美国安玛西亚公司产品。

1.3 动物实验 将30只1日龄SPF鸡随机分为2组，每组15只。试验组以2000 pfu/只的剂量腹腔接种MDV GA株；对照组接种等体积PBS。在相同条件下分别于负压隔离器中饲养。接种后4 d、7 d、14 d和21 d每只鸡分别采集4根～5根羽髓冻存于液氮中。

1.4 样品制备 将羽髓于液氮中充分研磨，每100 mg组织加入0.5 mL裂解液(7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%CHAPS、2%IPG缓冲液和40 mM DTT)，室温裂解1 h后，16℃ 15000 g离心30 min，吸取上清液。采用TCA-丙酮沉淀法浓缩蛋白，使用蛋白定量试剂盒测定浓度，进行等电聚焦或-80℃冻存备用。

1.5 双向电泳(2DE) 将350 μg样品稀释于水化液(7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、2%CHAPS、0.5%IPG缓冲液，0.002%溴酚蓝和20 mM DTT)中至终体积250μL，加入胶条槽，进行等电聚焦，程序为：30V恒压12 h；1 h内线性升压至200 V；2 h线性升压至500 V；1 h线性升压至1000 V；2 h线性升压至7000 V；7000 V恒压至36000 V。将其于10 mL平衡液Ⅰ中(50 mmol/L Tris-HCl、6 mol/L尿素、30%甘油、2%SDS和2%DTT)中作用15 min；转入10 mL平衡液Ⅱ(50 mmol/L Tris-HCl、6 mol/L尿素、30%甘油、2%SDS，2.5%Iodineacetamide)中作用15 min。将平衡后的胶条于12.5%SDS-PAGE胶中进行二向电泳；电泳条件为10 mA/胶，1 h后改为20 mA/胶，当溴酚蓝移至距分离胶下缘约1 mm时终止电泳。

1.6 蛋白可视化及图像分析 将凝胶置于10%乙酸中固定2 h，加入约90℃的R350染色液染色2 h，并以10%乙酸进行脱色。在分辨率为300 dpi的条件下使用ImageScanner扫描仪扫描凝胶。采用ImageMaster 2D Platinum version 6.0软件进行点检测、编辑、点匹配及数据分析。试验组和对照组各取3只鸡的羽髓进行检测，每个羽髓样品进行3次重复。分别对4个时期的试验组和对照组的二维凝胶进行对比并进行t检验，其中当蛋白点表达量差异大于2倍时，视为显著差异表达(上调或下调)。

1.7 质谱(MS)鉴定 采取显著差异表达蛋白点，由中国科学院上海生化所蛋白质组中心进行串联质谱(MS/MS)鉴定。

2 结果

2.1 羽髓组织蛋白样品的制备 采用7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲和强力去垢剂CHAPS联合使用的组织裂解液，平均每100 mg组织样品需要0.5 mL裂解液，测得不同批次的羽髓组织蛋白样品浓度在3.0 μg/μL～4.5 μg/μL 之间，提取的蛋白质浓度较稳定，表明该蛋白质提取方法可靠。

2.2 羽髓蛋白图谱 采用ImageMaster 2D Platinum软件进行分析，可分辨的蛋白点约700个，不同样品间的匹配率大于80%；而2DE方法的分辨率及可重复性均较高。

利用ImageMaster 2D Platinumt软件对各时期试验组和对照组图谱进行数据处理和分析，结果显示：在MDV感染后4 d检测到显著差异表达蛋白点为2个，其中上调表达为1个，下调表达为1个；感染后7 d检测到8个显著差异表达蛋白点，其中上调表达为5个，下调表达为1个；感染后14 d检测到25个显著差异表达蛋白点，其中上调表达为5个，下调表达为19个，试验组新增蛋白点1个；感染后21 d检测到9个显著差异表达蛋白点，其中上调表达为7个，下调表达为2个(图1)。

图1 羽髓上皮细胞蛋白图谱Fig.1 The differentially expressed proteins and correspending to the MS/MS identified protein numbers

2.3 差异蛋白的质谱鉴定及分析 本实验中质谱鉴定标准为：蛋白质得分在90分以上，并且理论等电点和分子量与该蛋白点在凝胶图谱中的位置相符。按照该标准，本研究鉴定出29个差异表达蛋白(表1、图1)

由Uniprot Knowledgebase(Swiss-Prot/TrEMBL)和Gene Ontology等数据库中查找MDV感染后显著差异表达的29种蛋白质的功能，显示其包括新陈代谢相关蛋白(25%)、增殖和凋亡相关蛋白(7%)、细胞骨架蛋白(7%)、信号传导蛋白(14%)、运输相关蛋白(15%)、转录相关蛋白(11%）、免疫相关蛋白(7%)和其他功能蛋白质(14%)(图2)。这些蛋白质分别定位于细胞质(27%)、过氧化物酶体(6%)、内质网(13%)、线粒体(20%)和细胞骨架(6%)，而其余为分泌型蛋白(13%)(图3)。

图2 MDV感染后鸡羽髓显著差异表达蛋白的生物学功能分类Fig.2 Analysis of significantly expressed proteins according to their biological process

图3 MDV感染后鸡羽髓显著差异表达蛋白的细胞内定位情况Fig.3 The locates of the significantly expressed proteins in the cellular component

3 讨论

MDV是严格的细胞结合病毒，但在羽囊上皮细胞内却可以形成带囊膜的完整病毒粒子，而其中的病毒通过羽屑释放到环境中进行传播，因此羽髓对于MDV感染性全病毒的复制和MDV的水平传播具有重要意义。本研究通过2DE方法分析鸡感染MDV后各时期羽髓上皮细胞差异表达蛋白的情况，并通过MS技术鉴定出29种差异表达的蛋白质，其中7种为能量代谢相关蛋白，占鉴定蛋白的25%。另外，检测结果显示，32%的差异表达蛋白定位于细胞质，主要与蛋白质的加工和转运有关，可能参与病毒蛋白质的翻译、折叠、组装和运输。

实验结果表明MDV感染羽髓的前期(1 d～7 d)差异表达的蛋白较少，这可能是由于在感染前期羽髓中的MDV载量较低(103copies/106cells～104copies/106cells)；而在感染后期(14 d～21 d)羽髓中MDV载量上升至感染前期的100倍～1000倍，因此差异表达的蛋白明显增多[2]。特别是在第14 d(第二次溶细胞感染期)，有21种差异表达蛋白被鉴定出来。而在该阶段，宿主细胞受MDV感染影响最大，易感鸡的感染往往表现最广泛和严重，在皮肤则会出现显著的羽囊上皮感染[5-7]。其中，部分差异表达蛋白与Niroshan等对MDV感染鸡脾脏差异蛋白质组学以及MDV感染易感品系鸡和抗性品系鸡脾脏差异蛋白质组学研究的结果相符[8-9]；但要了解各蛋白质在MDV完整感染性病毒粒子的形成中的作用，则需要对各个蛋白质进行深入研究。总之，本研究结果对差异表达蛋白在MDV复制过程中的功能研究具有重要作用，并为进一步研究羽髓中MDV与宿主的相互作用机制及感染性病毒粒子的成熟过程提供依据。

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