ABT中药合剂研制与防治实验性缓慢葡萄球菌病的研究

刘富来，冯翠兰

(佛山科学技术学院，广东 佛山 528231)

缓慢葡萄球菌属于凝固酶阴性葡萄球菌(Coagulase-negativestaphylococci，CNS)，该菌被 Kloos 等于1976年命名为松鼠葡萄球菌缓慢亚种(Staphylococcus sciurisubsp.lentus)，并由 Schleifer等在 1983年划分为葡萄球菌属的一个独立种，即缓慢葡萄球菌(Staphylococcus lentus)[1-2]。CNS曾被认为不具有致病性，但越来越多的研究表明CNS是人类及动物的致病菌，并在医院感染中占据重要地位。尤其对于新生儿、存在严重基础疾病或长期接受治疗的病人等免疫力低下的人群更易导致严重感染[3]。

盐酸小檗碱(Berberine hydrochloride)具有抗菌、抗炎、镇痛、抗癌等药理作用；茶多酚(Tea polyphe-nols，TP)具有抑菌、抗氧化等能力；黄芪多糖(Astragalus polysacharide，APS)能够增加机体的非特异性抵抗能力，临床常用作免疫增强剂。为研究对S.lentus病具有防治作用的中药合剂，本实验以正交方法筛选盐酸小檗碱、TP与APS联合使用的最佳剂量组合，组成ABT中药合剂，应用于小鼠实验性S.lentus病的治疗和预防保护，研究以正交试验的方法确定中药配伍的可行性，为筛选适合临床治疗S.lentus病的中药制剂提供依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和菌种 盐酸小檗碱(纯度>98%)购自上海康九化工有限公司；TPS(纯度>98%)购自上海瑞康动物药业有限公司；TP(纯度>98%)购自江西绿康天然产物有限责任公司；培养基购自广东环凯微生物科技有限公司；S.lentus(SL01)由佛山科学技术学院食品科学实验室自濒死病猪分离，并由广东省微生物分析测试中心鉴定([2010]SP1170)[4]。

1.2 实验动物 18日龄～22日龄SPF小鼠，雌雄各半，购自广东省医学实验动物中心，饲养至体质量30 g左右用于试验，试验前禁饲12 h。

1.3 S.lentus致小鼠发病模型的建立

1.3.1 菌液制备 挑取生长在LB平板上的S.lentus单菌落，接种于营养肉汤中37℃，摇振(100 r/min)培养20 h后转移至新鲜液体培养基中培养20 h，收集培养物，同时采用平板表面涂布法和YLN-30电脑控制菌落计数器进行活菌计数，调整S.lentus培养物含菌量，使其浓度为9.6×109cfu/mL。

1.3.2 S.lentus致小鼠发病模型的建立 将小鼠随机分为4组，每组11只。1组～3组为接种方式试验组，依次为腹腔注射、肌肉注射、灌胃口服，各组染菌剂量均为0.5 mL(9.6×109cfu/mL)；第4组为对照组，腹腔注射等体积生理盐水。接种后定期观察并记录小鼠的发病情况。无菌采集死亡小鼠组织脏器进行细菌分离培养，统计死亡率和细菌分离情况。

1.4 S.lentus对小鼠感染剂量试验 将小鼠随机分为7组，每组11只。1组～6组为试验组，分别经腹腔注射含菌量为9.6×108cfu/mL～9.6×103cfu/mL的S.lentus培养液0.5 mL；第7组腹腔注射等体积生理盐水。以死亡率小于100%的最小稀释度作为单因素试验、正交试验及预防和治疗试验的感染菌液。

1.5 3种药物治疗实验性S.lentus病的单因素试验

1.5.1 药物剂量 TPS的给药量为100 mg/kg～500 mg/kg，组间差为100 mg/kg；TP的给药量为30 mg/kg～150 mg/kg，组间差为30 mg/kg；盐酸小檗碱的给药量为10 mg/kg～50 mg/kg，组间差为10 mg/kg。以试验时小鼠平均体质量30 g，每只小鼠灌服药液0.5 mL计算，配制3种药物不同剂量组所需药液。

1.5.2 治疗实验性S.lentus病的单因素试验 将小鼠随机分为17组，每组33只，3种药物分别设置5个剂量组，另外设感染对照和健康对照各1组。健康对照组腹腔注射0.5 mL生理盐水，其余各组每只小鼠按4.8×107cfu的剂量腹腔注射S.lentus菌液。定期观察小鼠症状，至出现第一只感染病例时，各药物不同剂量组每只小鼠分别灌服对应剂量药液0.5 mL，对照组每只小鼠分别灌服等体积生理盐水。

1.6 利用正交试验配制ABT中药合剂处方 将3种药物作为因素，按照单因素试验结果选择3种药物的3个剂量，设计正交试验(表1)。并通过正交表L9(34)构成3种药物不同剂量配伍的9组复方，对应的每组试验小鼠33只。根据复方中各种药物的比例，按每只小鼠分别灌服药液0.5 mL进行正交试验。根据试验结果中最优组合，配制ABT中药合剂，用于对小鼠实验性S.lentus病的防治试验。

表1 正交试验因素与水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.7 ABT中药合剂对实验性小鼠S.lentus病的防治试验

1.7.1 治疗试验 将小鼠随机分成5组，每组33只，各组每只小鼠按4.8×107cfu的剂量腹腔注射S.lentus菌液，对照组腹腔注射等体积生理盐水。感染后出现首例发病小鼠时，灌胃口服各种对应浓度的ABT中药合剂0.5 mL，其中高、中、低试验组剂量分别为160 mg/kg、80 mg/kg和40 mg/kg，每天上午、下午各一次，连用5 d，健康对照组和感染对照组给予等量生理盐水，观察至连续7 d不出现新病例为止，统计死亡数和保护率。

1.7.2 预防保护试验 将小鼠随机分成5组，每组33只，每天饮水给予90 mg/kg、60 mg/kg和30 mg/kg剂量的ABT中药合剂，对照组不添加药物，至试验结束。投药后第4 d开始，试验组和感染对照组每只小鼠按4.8×107cfu剂量腹腔注射S.lentus菌液。观察至连续7 d不出现新病例为止，统计死亡数和保护率。

2 结果

2.1 小鼠发病模型的试验结果 经腹腔和肌肉注射，S.lentus均可导致小鼠沉郁、流泪，继而出现昏睡、身体卷缩变形，至第6 d～第18 d全部死亡，并由死亡小鼠各脏器中分离到S.lentus。而灌胃口服未导致小鼠明显的临床症状和死亡，表明接种方式对S.lentus的致病性具有一定影响。对照组小鼠未见异常。

2.2 S.lentus对小鼠感染剂量试验结果 试验组小鼠分别经腹腔注射含菌量为9.6×108cfu/mL～9.6×103cfu/mL的S.lentus培养液，结果显示，稀释度≤10-3即可引起小鼠感染死亡，原培养物含菌量为9.6×109cfu/mL，每只腹腔注射菌液0.5 mL，表明每只小鼠染菌量≥4.8×106cfu即可引起小鼠感染死亡。

2.3 3种药物治疗实验性小鼠S.lentus病单因素试验 分别以盐酸小檗碱30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg，TPS 200 mg/kg、300 mg/kg、400 mg/kg，TP 90 mg/kg、120 mg/kg、150 mg/kg剂量进行治疗，小鼠死亡率较低，具有较好的治疗效果(表2)。

2.4 正交试验结果 将3种药物作为因素，依单因素试验结果选择3种药物的3个剂量，进行正交试验，比较实验结果中3个因素死亡率，可见盐酸小檗碱为最重要因素；其次为TPS；而TP为不重要因素。按照各因素的最佳水平选择即盐酸小檗碱、TPS和TP的剂量分别为30 mg/mL、300 mg/mL和90 mg/mL(A1B2C1)，3种药物百分比为：盐酸小檗碱7.2%、TPS 71.4%、TP 21.4%(表3)。

2.5 ABT中药合剂对实验性小鼠S.lentus病的防治效果

2.5.1 治疗效果 以ABT中药合剂高、中、低剂量灌服给药治疗实验性小鼠S.lentus病，结果显示3者降低死亡率均大于45%，能够有效控制感染小鼠的临床症状，极显著降低死亡率(p<0.01)(表4)。

ABT中药合剂对S.lentus病治疗剂量达80 mg/kg以上时死亡率可以降低57.5%以上(与盐酸小檗碱单因素试验50 mg/kg剂量水平相当)，该剂量ABT中药合剂中盐酸小檗碱实际剂量为7.4 mg/kg，与单因素试验比较，盐酸小檗碱与TP和TPS配伍后疗效提高了近7倍(表4)。

表2 3种药物治疗实验性小鼠S.lentus病的单因素试验结果Table 2 Therapeutic effects of three drugs on mouse S.lentusdiseases detected by single factor experiment

表3 S.lentus病治疗效果的正交试验结果Table 3 Therapeutic effects of the drugs on mouse S.lentusdiseases by orthogonal test

2.5.2 预防效果 ABT中药合剂对受S.lentus感染的小鼠有较好的保护作用。投喂各剂量ABT中药合剂4 d，每只小鼠腹腔注射感染S.lentus4.8×107cfu的情况下，高剂量组和中剂量组小鼠均全部存活，低剂量组小鼠死亡率为21.2%，而感染对照组小鼠死亡率为57.6%。ABT中药合剂高、中、低剂量组降低死亡率的效果与感染对照组比较差异均极显著(p<0.01)。表明应用ABT中药合剂预防S.lentus病时，剂量达60 mg/kg以上即可得到可靠的效果。

表4 ABT中药合剂治疗实验性S.lentus病小鼠的试验结果Table 4 Effect of ABT mixture on mouse experimental S.lentusdiseases

3 讨论

本研究结果表明，经腹腔注射可复制出典型的S.lentus病例，当每只小鼠S.lentus感染剂量达4.8×106cfu时，即可能引起小鼠感染死亡，这与盛相鹏等认为该菌具有较强致病力的观点一致[5]。

盐酸小檗碱、TPS和TP单独或配伍使用对防治E.coli、提高机体免疫力以及改善鸡蛋品质具有显著效果[6-8]。本研究单因素试验结果也表明盐酸小檗碱、TPS和TP单独使用对治疗小鼠S.lentus病具有不同程度的疗效，将它们配伍制成ABT中药合剂对S.lentus具有较强的抵抗作用，并且抗菌能力与药物浓度呈正相关。而ABT中药合剂的剂量达到60 mg/kg时，可以较好地保护小鼠免受病原侵袭，表明盐酸小檗碱用于治疗细菌病具有良好效果，ABT中药合剂中各组分无明显拮抗作用，其中盐酸小檗碱的疗效比单方用药提高近7倍，显示ABT中药合剂对防治S.lentus病具有良好的应用前景。

细菌引起的疾病是威胁养殖业的重要因素，而抗生素的长期滥用导致耐药菌株种类增多，因此，急需研制一种既可以有效防治细菌性疾病、药理作用机制明确，又能够替代抗生素的新型中药制剂。盐酸小檗碱与TP和TPS配伍构成ABT中药合剂既能够直接作用于病原体，又能够增强机体的非特异性防御能力，符合中药配伍原则，也符合“药有个性之特长，方有合群之妙用”的中药配伍理论。

以中药材中活性成分作为配伍对象，将药物配伍改为组分配伍制成ABT中药合剂，其高、中、低剂量组降低死亡率的效果与感染对照组比较差异均极显著(p<0.01)，也证明中药配伍理论和中药组分学的科学性，为临床筛选治疗S.lentus病的中药材提供试验依据，但对于S.lentus的致病机理以及ABT中药合剂的作用机制还需进一步研究。

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